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    公开号:WO1991006006A1
    申请号:PCT/JP1990/001355
    申请日:1990-10-19
    公开日:1991-05-02
    发明作者:Eiji Matsuura；Yoshiko Igarashi；Hisato Nagae
    申请人:Yamasa Shoyu Kabushiki Kaisha；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書 抗リ ン脂質抗体結合用担体、 それを使用する免疫学的 測定法およびキッ ト 技術分野
    [0002] 本発明は、 抗リ ン脂質抗体結合用担体、 それを使用す る免疫学的測定法およびその測定法に使用するキ 'ン ト、 並びにこれらの測定法に用いることのできる血清もし く は血漿から得られる分画物及び蛋白質に関し、 特に抗リ ン脂質抗体症候群に特異的な自己抗体の測定に関するも のである。
    [0003] 背景技術
    [0004] 生体内に侵入した病原性ウィルス、 細菌、 真菌、 寄生 虫等の外来性異物に対し、 生体は免疫応答を起こし、 こ れを排除するように働く。 この現象は一般に抗体の関与 する液性免疫、 および直接免疫担当細胞が関与して異物 を排除する細胞性免疫の二種類に大別される。 ところが、 自己免疫疾患と総称される病態においては、 自己、 非自 己の認識機構が正常に働かず、 自己の細胞や組織に対し て液性あるいは細胞性の免疫応答が起こる。 自己成分に 対して反応する抗体 （自己抗体） が出現する代表的な臨 床例としては、 全身性エリテマ トーデス （ S L E ) があ り、 血中に抗一本鎮 D N A抗体、 抗ニ本鎮 D N A抗体、 抗 S m抗体、 抗カルジオリ ビン抗体等の出現が認められ る。 また慢性関節リ ウマチ （ R A) でリ ウマチ因子が、 シェーグレン症候群 （ S J S ) で抗 S S— A抗体、 抗 S S— B抗体および抗ミ トコ ン ドリァ抗体が、 全身性強皮 症 （ P S S ) で、 抗 s c l抗体および抗一本鎖 D N A抗 体が、 また混合型結合織病 （M C T D ) で抗 R N P抗体 が見い出される。 現在のところ、 これら抗体の出現と病 態の発症意義の関連については不明な点も多いが、 抗体 を測定することは病気の診断および予後の病態の変化を 知る上で重要な手段である。
    [0005] これら種々の自己抗体を検出するため、 抗体の抗原特 異性、 生化学的特性、 および物理化学的性状に応じて、 免疫拡散法、 対面免疫電気泳動法、 赤血球凝集法、 ラジ オイムノアツセィ法 （ R I A法） 、 酵素免疫測定法 （ E I A法） およびラテックス凝集法などが開発されている， ところで、 前述の抗カルジオリ ビン抗体の測定法に閬 しては 1 9 4 0年代後半に梅毒の診断 （マススク リー二 ング） 用として免疫沈降法が初めて開発された。 しかし ながら、 この方法を用いた診断では感度が低いという欠 点の他、 全身性ェリテマ ト一デス （ S L E ) の患者血清 で、 高頻度の生物学的偽陽性が出現することが問題とな つていた。 ところが、 近年、 動脈および静脈の血栓症、 流産、 血小板滅少症の症状を示すルーブス様症候群を発 症する若い女性患者の血中に高濃度の抗カルジオリオビ ン抗体の出現が認められ、 抗カルジオリ ビン抗体を測定 することによってこれらの疾患を診断することの臨床的 意義についても高い評価を受けるに至っている。
    [0006] このような状況で、 ループスコアグラン ドの非特異的 測定法や生物学的偽陽性が高頻度に認められる抗カルジ オリ ビン抗体免疫沈降測定法などの従来の方法に代わる 高感度かつ高精度な測定法に期待が寄せられてきた
    [0007] ( Proctor, R.R. & Rapaport, S.L. , Am. J. Clin.
    [0008] Pathal. , M> 212, (1961); Exner, T. et al. ,
    [0009] British J. Haematol. , 40, 143, (1978); Margolios, Λ. , Medicine 40. 145 (1961)) 。 そして、 1 9 8 3年、 ハリ スら（ Harris, E.N. et al. , Lancet, 1211-1214,
    [0010] (1983) )によって抗カルジオリ ビン抗体測定用 R I Aが 開発された。 その後も R I A以外の方法として、 アル力 リホスファターゼ等の酵素をラベルした標識抗体を用い た非競合法 （サン ドィ ッチ法） による E I A法が開発さ れてきている。 この種の E I A法によるカルジオ リ ビン 抗体の測定は定量性があり、 簡便で、 S L E等驂原病患 者の診断および経過観察に適している他、 基礎医学の領 域では抗カルジオリ ビン抗体の特異性解折に用いられて いる。 また近年、 膠原病の領域のなかでも、 特に習慣性 流産が抗カルジ才リ ビン抗体等の抗リ ン脂質抗体の出現 に起因する血栓症によるもの （抗リ ン脂質抗体症候群） であるとの見方が強まってきており、 産婦人科領域でも 抗カルジォリ ビン抗体の測定に期待が寄せられている。 血中抗カルジオリ ビン抗体のサブクラスは、 I g G、 I g M、 I g Aなど多様であるが、 S L E患者血清中に は比較的、 I g Gまたは I g Mクラスが出現することが 多い。
    [0011] また、 抗リ ン脂質抗体症候群に特異的な抗体の各々の 特異抗原と思われる d s D N A (二本鎖 D N A抗体） 、 s s D N A (一本鎖 D N A ) 、 カルジオリ ビン、 ホスフ ァチジルセリ ン、 ホスファチジルイ ノ シ トールなどには、 それらのリ ン酸エステルを中心とする限定された極性部 位に類似の分子構造が存在し、 現在、 これら抗体の異同 性についても議論の対象となっている。
    [0012] 前述のように S L E、 習慣性流産等、 抗リ ン脂質抗体 症候群の診断用の測定系として、 抗カルジオリ ビン抗体 を測定するための R I A法、 E I A法が種々の施設で開 発されているが、 それらの測定系には、 いまだ以下の通 りの問題点が残されている。
    [0013] すなわち、 抗原固相化担体を用いる方法では、 S L E 等の患者血清を測定に供す'る場合、 適切なブロ ッキング 剤を用いない限り非特異的吸着によりカルジォリ ビンに 特異的な抗体の定量が困難なことがある。 ブロ ッキング 剤として通常使用されているゥシ胎児血清 （ F B S ) を 用いる場合、 S L E由来の抗カルジオリ ビン抗体とその 他の外来性要因 （例えば、 感染症等） の抗カルジオリ ビ ン抗体との分別定量が不可能であり、 このような目的に 適合するプロ ッキング剤は見いだされていない。
    [0014] 発明の開示
    [0015] 本発明者らは、 抗リ ン脂質抗体症候群に特異的に存在 する抗リ ン脂質抗体を選択的に補捉する抗リ ン脂質抗体 結合用担体および抗リ ン脂質抗体症候群の特異的な診断 法として実用化し得る抗リ ン脂質抗体の高精度かつ高感 度な測定法を開発すべく種々の研究を重ねてきた。 その 結果、 次のような手段で前述の問題点を解消し、 本発明 を完成した。
    [0016] すなわち、 本発明は、
    [0017] ( 1 ) リ ン脂質を結合した担体物質が精製血清アルブミ ンおよび界面活性剤で処理されていることを特徴とする 抗リ ン脂質抗体結合用担体、
    [0018] ( 2 ) リ ン脂質を結合した担体物質が精製血清アルブミ ン、 界面活性剤および血清、 血漿、 その分画物もし く は その分画物中の蛋白質で処理されていることを特徴とす る抗リ ン脂質抗体結合用担体、
    [0019] ( 3 ) リ ン脂質が結合した抗リ ン脂質抗体結合用担体と 被検液とを接触させて抗リ ン脂質抗体症候群に特異的に 存在する抗体と該担体に結合したリ ン脂質との免疫複合 体を形成させて該抗体を検出する方法において、 抗リ ン 脂質抗体結合用担体として上記 （ 1 ) または （ 2 ) の担 体を使用することを特徴とする免疫学的測定法。
    [0020] ( 4 ) 抗リ ン脂質抗体結合用担体と被検液とを接触させ て被検液中の抗リ ン脂質抗体と担体上のリ ン脂質との免 疫複合体を形成させる第 1 の抗原抗体反応 （以下、 1次 反応という こともある。 ） 工程と、 該免疫複合体と標識 抗ィ ムノグロプリ ン抗体とを反応させて該免疫複合体と 標識抗ィムノ グロプリ ン抗体とからなるサン ドイ ッチ状 免疫複合体を形成させる第 2の抗原抗体反応 （以下、 2 次反応という こともある。 ） 工程と、 ついで該サン ドィ ツチ状免疫複合体を舍む相と担体に結合しなかった物質 を舍む相とを分離する分離工程と、 いずれかの相の標識 物質 （マーカー） を検出する検出工程とからなる方法に おいて、 抗リ ン脂質抗体結合用担体として上記 （ 1 ) ま たは （ 2 ) の担体を使用し、 かつ少なく とも第 1 の抗原 抗体反応工程を反応液に被検液と同種もしく は類縁の動 物に由来する血清、 血漿、 その分画物もしく はその分画 物中の蛋白質を添加して行う ことを特徴とする免疫学的 測定法、
    [0021] ( 5 ) 抗リ ン脂質抗体結合用担体と被検液とを接触させ て被検液中の抗リ ン脂質抗体と担体上のリ ン脂質との免 疫複合体を形成させる第 1 の抗原抗体反応工程と、 該免 疫複合体と標識抗ィムノグロブリ ン抗体とを反応させて 該免疫複合体と標識抗ィムノグロブリ ン抗体とからなる サン ドイ ツチ状免疫複合体を形成させる第 2の抗原抗体 反応工程と、 ついで該サン ドィ ッチ状免疫複合体を舍む 相と担体に結合しなかった物質を舍む相とを分離する分 離工程と、 いずれかの相の標識物質 （マーカー） を検出 する検出工程とからなる方法において、 抗リ ン脂質抗体 結合用担体がリ ン脂質を結合した担体物質を界面活性剤 で処理したものであること、 および少なく とも第 1の抗 原抗体反^工程を反応液に被検液と同種もしく は類縁の 動物に由来する血清、 血漿、 その分面物もしく はその分 画物中の蛋白質を添加して行う ことを特徴とする免疫学 的測定法、
    [0022] ( 6 ) 少なく とも下記構成試薬から構成される上記 （ 4 ) の免疫学的測定法に使用するキッ ト ；
    [0023] ( A ) 上記 （ 1 ) または （ 2 ) の抗リ ン脂質抗体結合 用担体、
    [0024] ( B ) 標識抗ィムノ グロプリ ン抗体、
    [0025] ( C ) 被検液と同種もしく は類緣の動物に由来する血 清、 血漿、 その分画物もしく はその分画物中の 蛋白質を添加した検体希釈液、
    [0026] ( 7 ) 少なく とも下記構成試薬から構成される上記 （ 4 ) の免疫学的測定法に使用するキ ッ ト ；
    [0027] ( Α ' ) リ ン脂質を結合した担体物質が界面活性剤で 処理されている抗リ ン脂質抗体結合用担体、
    [0028] ( Β ) 標識抗ィムノ グロプリ ン抗体、
    [0029] ( C ) 被検液と同種もしく は類緣の動物に由来する血 清、 血漿、 その分画物もしく はその分画物中の 蛋白質を添加した検体希釈液、
    [0030] ( 8 ) 血清もしく は血漿をゲル濾過して得ることができ る分画物であって、 抗リ ン脂質抗体症候群に特異的に存 在する抗リ ン脂質抗体とリ ン脂質との結合性を高める作 用を有する分面物、
    [0031] ( 9 ) 血清もしく は血漿から得ることができる分画物で あって、 抗リ ン脂質抗体症候群に特異的に存在する抗リ ン脂質抗体とリ ン脂質との結合性を高める作用を有し、 且つ以下の理化学的性質を有する分画物 ：
    [0032] ①分画分子量 6 , 0 0 0〜8 , 0 0 0 のセルロース膜を用い て透析すると非透折画分に含まれる ；
    [0033] ②ゲル濾過または S D S —ポ リ アク リルァミ ドゲル電気 泳動によって分画すると血清アルブミ ンの近傍か、 僅か に低分子側に確認される ；
    [0034] ③ブロティ ン Aと結合しない ；
    [0035] ④ジェチルァ ミノェチル基を舍む弱塩基性陰ィォン交換 体によるクロマ トグラフィーにおいて I g G画分の近傍 に溶出される ；
    [0036] 及び⑤ 3 0〜6 0 %飽和硫酸ァンモユウムで塩折される 酉分に含まれる
    [0037] ( 10 ) 血清もしく は血漿から得ることができる蛋白質で あって、 抗リ ン脂質抗体症候群に特異的に存在する抗体 とリ ン脂質との結合性を高める作用を有し、 且つ以下の 理化学的性質を有する蛋白質 ：
    [0038] ① S D Sボリアク リルアミ ド電気泳動により測定される 分子量が約 5 0 , 0 0 0 ± 2 , 0 0 0で等電点が約 6 . 6 0士 0 . 4であり ；
    [0039] 及び②リ ン脂質に対して結合性を有する、
    [0040] ( 11 ) 健常人血清から上記 （10 ) 記載の蛋白質を単離精 製するに際し、 後述する式 〔 1 〕 で表わされるリ ン脂質 からなるリポソーム、 該リ ン脂質を結合したァフィニテ ィ一吸着剤あるいは該リ ン脂質を 1つの構成成分とする リ ボソームを用いて精製する工程を舍むことを特徴とす る上記 （10 ) 記載の蛋白質の製造法。
    [0041] ( 12 ) リ ン脂質が結合した抗リ ン脂質抗体結合用担体と 被検液とを接触させて抗リ ン脂質抗体症候群に特異的に 存在する抗体と該担体に結合したリ ン脂質との免疫複合 体を形成させて該抗体を検出する方法において、 該免疫 複合体を形成させる際に、 反応液中に高濃度の血清もし く は血漿を存在させるか、 反応液中に上記 （ 8 ) もしく は （ 9 ) 記載の分画物または上記 （10 ) 記載の蛋 S質を 存在させることを特徴とする免疫学的測定法、
    [0042] (13) リ ン脂質が結合した抗リ ン脂質抗体結合用担体と 被検液とを接触させて抗リ ン脂質抗体症候群由来の抗リ ン脂質抗体と感染症由来の抗リ ン脂質抗体とを分別検出 する方法であって、 リ ン脂質が結合した抗リ ン脂質抗体 結合用担体と被検液とを接触させる際に、 反応液中に高 濃度の血清もしく は血漿を存在させるか、 反応液中に上 記 （ 8 ) もしく は （ 9 ) 記載の分画物、 または上記 （10) 記載の蛋白質を存在させて接触させる方法と、 これらを 存在させないで接触させる方法の両者を実施して、 抗リ ン脂質抗体症候群由来の抗リ ン脂質抗体と感染症由来の 抗リ ン脂質 体とを分別検出する方法。
    [0043] ( 14 ) 高濃度の血清もしく は血漿、 上記 （ 8 ) もしく は ( 9 ) の記載の分画物または （10 ) 記載の蛋白質を構成 試薬の 1つとして含む、 抗リ ン脂質抗体症候群に特異的 に存在する抗体を測定する免疫学的測定法に使用するキ 'ン 卜、
    [0044] を要旨とするものである。
    [0045] 図面の簡単な説明
    [0046] 第 1図 （A ) 、 ( B ) 、 ( C ) は、 それぞれ従来法に よる参考例、 本発明の効果を示す比較実験例、 本発明方 法の実施例において抗リ ン脂質症候群由来の A s血清お よび感染症由来の Y a血清の抗リ ン脂質抗体価の指標と しての吸光度 （ 4 5 0 n m ) を測定した結果を示すもの である。
    [0047] 第 2図は、 第 1図 （ C ) の実施例とは別の方法で作成 した抗リ ン脂質抗体結合用担体を用いて A s血清および Y a血清の抗体価の指標としての吸光度 （ 4 5 0 n m ) を測定した結果を示すものである。
    [0048] 第 3図は添加した健常人血清の濃度 （希釈度） と抗体 価の指標としての吸光度 U50n»)の関係を示すものであ る。
    [0049] 第 4図は、 健常人血清のゲル濾過パターンと、 その分 酉物を添加して 1次反応を行う ことによって測定した A s血清および Y a血清の抗体価の指標としての吸光度 U50nn)との関係を示すものである。
    [0050] 第 5図は、 健常人血清の H P L C法によるゲル濾過パ ターンと、 その分画物を添加して 1次反応を行う ことに よって測定した A s血清の抗体価の指標としての吸光度 ( 450η·)との関係を示すものである。
    [0051] 第 6図は、 健常人血清のプロテイ ン Α—セファ ロース カラムによる分画パターンを示すものである。
    [0052] 第 7図は、 健常人血清の D E A E —セルロースカ ラム による分画バターンと A s血清の抗体価の指標としての 吸光度 （450 nm)との関係を示すものである。
    [0053] 第 8図は、 健常人血清の硫酸アンモニゥムによる分画 と A s血清の抗体価の指標としての吸光度 （450nm)との 閬係を示すものである。
    [0054] 第 9図は、 本発明方法によって健常人血清と抗リ ン脂 質抗体症候群患者血清の抗体価 （ユニッ ト ： u n i t/ ； 以下 Uとする） を測定した結果を示すものである。
    [0055] 第 1 0図は、 本発明方法および従来法によって測定し た自己免疫疾患患者血清の抗体価 （ U ) について、 両者 の相関を求めた結果を示すものである。
    [0056] 第 1 1図は、 S L E患者血清について本発明方法の希 釈直線性をもとめたものである。
    [0057] 第 1 2図は、 自己免疫疾患患者および感染症 （結核性 髄膜炎、 梅毒） 患者の血清について、 本発明方法 （網掛 け） と対照方法 （白抜き） によって抗体価の指標として の吸光度（450n«) を測定した結果を示すものである。 第 1 3図は、 1次反応液として H E P E Sを舍む緩衝 液を使用して A s血清の抗体価の検量線を作成した結果 を示すものである。
    [0058] 第 1 4図は、 健常人血清の D E A E —セルロース （ D E - 5 2 ) カ ラムによるイオン交換ク ロマ トグラフ ィー の分画バターンを示すものである。 第 1 5図は、 第 1 4図に示したィォン交換クロマ トグ ラフィ一により得られた抗カルジオリ ビン · コファ クタ 一活性舍有画分をプロティ ン A—セルロースカ ラムク ロ マ トグラフィ一に付した時の分画パターンを示すもので ある。
    [0059] 第 1 6図は、 第 1 5図に示したクロマ トグラフィーに より得られた抗カルジオリ ビン · コファクター活性舍有 面分を抗ヒ ト I g G抗体一セファ ロース C L— 4 Bカラ ムによるァフ ィ 二ティーカ ラムク ロマ トグラフィ一に付 した時の分画バターンを示すものである。
    [0060] 第 1 7図は、 抗カルジオリ ビン · コファ クターを S D S—ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動に付して得られた 結果を示すものである。
    [0061] 第 1 8図は、 リボソームにより精製した抗カルジオリ ビン ' コファ クターを H P L Cに付した時の分離パター ンを示すものであり、 矢印で示したビーク部分が抗カル ジオリ ビン · コファ クターに相当する。
    [0062] 第 1 9図は、 第 1 6図に示した抗ヒ ト I g G抗体ーセ ファ ロース C L— 4 Bカラムによるァフ ィ二ティーカラ ムクロマ トグラフィーにより得られる抗カルジオリ ビン
    [0063] • コファ クタ一活性舍有画分を I S 0 D A L T電気泳動 に付して得られた結果を示すものである。
    [0064] 第 2 0図は、 ビォチン化抗カルジォリ ピン ' コファク ターのカルジオリ ビン固相化ブレー トへの濃度依存的な 結合性を示すグラフである。 第 2 1図は、 抗カルジオリ ビン ' コファ クターのリ ン 脂質に対する結合特異性を示すグラフである。
    [0065] 第 2 2図は、 抗カルジオリ ビン抗体 （A s抗体） の抗 カルジオリ ビン · コファクター依存性を示すグラフであ る。
    [0066] 第 2 3図は、 抗カルジオリ ビン抗体の反応系における 抗カルジオ リ ビン · コファ クターの種特異性を示すダラ フである。
    [0067] 第 2 4図は、 健常人血清の D E A E —セルロース · 力 ラムクロマ トグラフィーによる分画バターンを示すもの である。
    [0068] 第 2 5図は、 健常人血清のへパリ ンセファ ロース ' 力 ラムクロマ トグラフィ一による分画パターンを示すもの である。
    [0069] 第 2 6図は、 健常人血清のカルジォリ ビン一ポリアク リルア ミ ドゲルカラムクロマ トグラフィ 一による分画バ ターンを示すものである。
    [0070] 第 2 7図は、 精製ゥシ血清アルブミ ンが本発明の免疫 測定法に及ぼす影響を示したものである。
    [0071] 発明を実施するための最良の形態
    [0072] 以下本発明を具体的に説明する。
    [0073] 1 . リ ン脂質
    [0074] 本発明における リ ン脂質は、 そのホスホジエステル結 合の近位に電子供与性官能基を有するものであればよ く、 特に一般式 〖 I ] C H z - 0 - R
    [0075] I [ I I
    [0076] C H — 0
    [0077] [式中、 R 1 および R 2 は同一または異なり、 炭素鎖 中にアルキル基もしく はアルケニル基を有するァシル基.
    [0078] R
    [0079] アルキル基またはアルケニル基を示し、 R 3 は水素原子 または一 （ C H2 ) n - C H R 4 - R 5 を示し、 R4 は 水素原子、 水酸基、 カルボキシル基、 ホルミル基、 メ ル カプト基もしく はハロゲン原子を示し、 R5 はァ ミノ基. ヒ ドロキシアルキル基もし く は一般式
    [0080] [ Π ]
    [0081] C H 2 - 0 - R 1
    [0082] [ Π 3
    [0083] C H ― 0— R 2
    [0084] I 0
    [0085] C H 2 一 0— P 0 - C H 2 一
    [0086] 0 H
    [0087] [式中、 R 1 および R2 は前記と同意義。 ] で表され る置換基を示し、 または R4 と R5 とで糖もしく は糖ァ ルコール残基を示し、 nは 0ないし 3の整数を示す。 ] で表されるグリ セ口 リ ン脂質が好ましい。 このグリセ口 リ ン脂質は陰性荷電を有するものであり、 このようなグ リ セロ リ ン脂質として具体的にはカルジォリ ピン、 ホス ファチジルセ リ ン、 ホスファチジルイ ノ シ トール、 ホス ファ チジルグリ セロールまたはホスファチジン酸が例示 される。
    [0088] 特にカルジオリ ビンが好ましい。 カルジオリ ビンは通 常牛などの哺乳動物の心臓、 大腸菌などの微生物から調 製されるが、 特に哺乳動物の心臓から得られるものが好 ましい。
    [0089] これらは、 その由来、 脂肪酸組成、 精製度などには限 定されず、 塩型であっても、 遊離型であってもよ く、 担 体物質への結合に際して溶解すべき溶媒も限定されない 力、'、 精製度は試薬級以上のものが好ましい。
    [0090] 2 . 担体物質
    [0091] 本発明において使用される担体物質としては、 リ ン脂 質を結合することができ、 測定に際し、 免疫反応 （抗原 抗体反応） を阻害しないものであれば特に限定されない が、 B F分離 （免疫反応において免疫複合体を形成した 標識体と遊離の標識体との分離をいう。 ） が容易に行え ることを考盧すると、 反応液に不溶性の担体物質 （固相） が好ましい。
    [0092] 反応液に不溶性の担体物質の材質としては、 例えばポ リ塩化ビュル、 ポリ スチレン、 スチレン一ジビニルベン ゼン共重合体、 スチレン一無水マレイ ン酸共重合体、 ナ ィ ロ ン、 ポリ ビュルァノレコール、 ボリ アク リルア ミ ド、 ポリ アク リ ロニ ト リル、 ポリ プロピレン、 ポリメ チレン メタク リ レー トなどの合成有機高分子化合物、 デキス ト ラ ン誘導体 （セフ アデッ クスなど） 、 ァガロースゲル (セファ ロース、 バイオゲルなど） 、 セルロース （ぺー パー ' ディ スク、 濾紙など） などの多糖類、 ガラス、 シ リ力ゲル、 シリ コーンなどの無機高分子化合物が挙げら れ、 これらはァ ミノ基、 ア ミノアルキル基、 カルボキシ ル基、 ァシル基、 水酸基などの官能基を導入したもので あってもよい。 なお、 担体物質の材質は蛋白質の結合能 の低いものが好ましく、 このような材質としては未処理 のポリ スチレン、 ポリ塩化ビュルが例示される。
    [0093] 反応液に不溶性の担体物質の形状は、 平板状 （マイ ク ロタイ タ一プレー ト、 ディ スクなど） 、 粒子状 （ビーズ など） 、 管状 （試験管など） 、 繊維状、 膜状、 微粒子状 (ラテックス粒子など） 、 力プセル状、 小胞体状、 リポ ソーム状 （多層もしく は単層の脂質膜） などが例示され、 測定法に応じた適宜な形状の担体を選択することができ る。
    [0094] 3 . 抗リ ン脂質抗体結合用担体
    [0095] 本発明における抗リ ン脂質抗体結合用担体は上記リ ン 脂質を上記担体物質に結合させたものである。 リ ン脂質 と担体物質との結合法は、 物理的吸着法、 イオン結合法- 共有結合法、 包括法など公知の方法 （例えば、 「固定化 酵素」 （千畑一郎編、 昭和 5 0年 3月 2 0 日、 ㈱講談社 発行） 参照） を採用することができる。 とりわけ、 物理 的吸着法は簡便である点で好ましい。 また、 リ ン脂質と 担体物質との結合は、 直接行ってもよく、 両物質の間に 他の物質を介して行ってもよい。 物理的吸着法によつてリ ン脂質を担体物質に結合させ るには、 通常、 リ ン脂質の有機溶媒 （メ タノール、 エタ ノール、 クロ口ホルムなどリ ン脂質を溶解できる有機溶 媒） 溶液を担体物質と一定時間接触させ、 溶液の有機溶 媒を留去する方法を用いることができる。 溶媒の留去は 減圧乾燥、 通風乾燥などの公知の方法によって行う こと ができる。 また、 リ ン脂質の有機溶媒溶液から溶媒を留 まするこ とによってリ ン脂質を担体物質以外の物質の表 面に一旦吸着させ、 これを緩衝液 （例えば、 ナ ト リ ウム 系、 カ リ ウム系またはナ ト リ ウム一カ リ ウム系のリ ン酸 緩衝食塩水） などに懸濁した後、 この懸濁液と担体物質 を一定時間 （例えば、 数十分〜数時間） 、 反応を阻害し ない温度条件下 （例えば、 0〜 5 0 て） で接触させ、 次 いで溶液を吸引、 傾寫、 遠心分離などの方法によって除 去し、 さらに必要に応じて乾燥 （滅圧乾燥、 通風乾燥な ど） する方法によってリ ン脂質を担体物質に結合させる こともできる。
    [0096] 本発明において使用される抗リ ン脂質抗体結合用担体 は、 界面活性 だけで処理されたもの、 精製血清アルブ ミ ンと界面活性剤の二種を併用して処理されたもの、 ま たは精製血清アルブミ ン、 界面活性剤および血清、 血漿、 その分西物もしく はその分画物中の蛋白質の三種 （以下 これらを処理物質という こともある） を併用して処理さ れているものが好ましい。 尚、 反応液中に高濃度の血清 もしく は血漿を存在させて、 または本発明で得られる後 述する血清もしく は血漿から得られる分画物あるいは蛋 白質を存在させて、 抗リ ン脂質抗体結合用担体に結合し たリ ン脂質と被検液中の抗リ ン脂質抗体との免疫複合体 を形成させる抗原抗体反応を行う場合には、 必ずしも上 記した本発明の抗リ ン脂質抗体結合用担体を使用しなく ともよい。 ここで 「処理」 とは、 抗リ ン脂質抗体結合用 担体に対し、 これらの処理物質が作用し、 物理的もしく は化学的に結合しうる操作をいう。 具体的には、 このよ うな処理は、 リ ン脂質を担体物質に結合させた後、 処理 物質を舍有する溶液のそれぞれを、 順次に （順番は無閬 係） 、 もしく はこれらの物質の二種か三種を舍有する溶 液を担体物質と一定時間 （例えば、 数十分〜数時間） 、 反応を阻害しない温度条件下 （例えば、 0 〜 5 0 'C ) で 接触させることによって行う ことができる。 このような 処理を行うに際し、 これらの処理物質を溶解する溶媒は 特に限定されないが、 通常は锾衝液 （ナ ト リ ウム系、 力 リ ウム系またはナ ト リ ウム一カ リ ウム系のリ ン酸緩衝生 理食塩水など） などが使用される。 また、 このような処 理を行う際に処理液に糖類 （シユ ークロースなどの少糖 類、 デキス ト リ ン、 サイ ク ロデキス ト リ ン、 デキス トラ ンなどの多糖類、 単糖類など） などを共存させてもよい < 上記の処理を行った抗リ ン脂質抗体結合用担体を使用 することによって第 1 の抗原抗体反応 ( 1次反応） 工程 において抗リ ン脂質抗体結合用担体に感染症に由来する 抗リ ン脂質抗体が結合することを防止できる。 なお、 こ のような処理を行う ことによる他の効果として、 非特異 的吸着の防止 （担体物質上のリ ン脂質非結合部分への抗 リ ン脂質抗体、 標識抗体の結合防止） 、 担体物質上のリ ン脂質への抗リ ン脂質抗体症候群に特異的に存在する抗 リ ン脂質抗体の結合能の増強、 担体物質上のリ ン脂質の 安定化などを挙げることができる。
    [0097] 本発明で使用される精製血清アルブミ ンとは、 牛、 馬, 犬、 猫、 山羊、 羊、 豚、 鶏、 兎、 ラ ッ ト、 マウス、 ヒ ト などの動物の血清から公知の方法で精製されたものであ り、 分画 V (コーンの低温エタノール分画法、 ヒー トシ ョ ック法、 塩折などによる） より も精製度の高いもので、 本発明の目的に適合するものをいう。 すなわち、 具体的 には、 例えば分画 Vを活性炭処理、 ク ロマ トグラフィー (ィォン交換ク口マ トグラフィーなど） 、 結晶化によつ て精製したもの、 あるいは分画 Vを精製したものと同等 の精製度を有し、 他の方法で精製されたものであり、 特 に脂質舍量を減少させたものが好ましい。
    [0098] また、 血清、 血漿、 その分画物もしく はその分面物中 の蛋白質 （以下、 これらを 「本発明血液成分」 という こ ともある） とは、 動物の血液から公知の方法によって製 造される血清または血漿そのもの、 それらを分画して得 られる分画物またはその分画物をさらに精製して得られ る蛋白質である。 その由来は、 測定すべき被検液と同種 の動物であることが好ましいが、 類縁の動物に由来する ものであってもよい。 このような本発明血液成分は、 後 述する一次反応時に添加するものと本質的に同様のもの である。
    [0099] なお、 従来リ ン脂質を結合した担体を牛胎児血清、 牛 新生児血清、 牛血清アルブ ミ ン、 界面活性剤などで処理 することは行われていたが、 このような従来法では抗リ ン脂質抗体結合用担体に感染症に由来する抗リ ン脂質抗 体が結合することを防止できなかった。 また、 従来使用 されていた牛血清アルブ ミ ンはコーンの低温エタノール 分画法による分画 Vなど未精製のものであった。
    [0100] 本発明で使用される界面活性剤には非イオン性、 両性、 陰イ オ ン性、 陽イ オ ン性のものが包含されるが、 とりわ け非イオン性界面活性剤が好適である。 非イ オ ン性界面 活性剤としては、 具体的にはポリオキシエチレングリ コ ールソルビタ ンアルキルエステル類 （例えば、 ト ウ ィ ー ン （Tween )系界面活性剤など） 、 ァシルソルビタ ン類
    [0101] (例えば、 スパン （Span) 系界面活性剤、 ァラセル （Ar l acel )系界面活性剤など） 、 ボリォキシエチレングリ コ ールアルキルフ ヱ ニルエーテル類 （例えば、 ト リ ト ン ( Tri ton) 系界面活性剤など） 、 しょ糖脂肪酸エステル 類などを例示できる。
    [0102] なお、 本発明の抗リ ン脂質抗体結合用担体は、 免疫学 的測定にだけでなく 、 抗リ ン脂質抗体を選択的に吸着除 去または分離精製するための種々の用途に使用できる。 例えば、 血漿交換療法において、 抗リ ン脂質抗体の選択 的な吸着体として使用できる （例えば、 特開平 1 一 6 8 2 7 3参照） 。 また、 抗リ ン脂質抗体を分離精製するた めのァフ ィ 二ティーク ロマ トグラフ ィ一用吸着剤として も使用できる。
    [0103] 尚、 後述の一次反応において本発明血液成分を反 ίδ液 中に存在させて反応を行う場合には、 これらの処理物質 で処理された担体を使用する代わりに、 従来公知のリ ン 脂質抗体結合用担体を使用することもできる。
    [0104] 4 . 抗リ ン脂質抗体症候群
    [0105] 本発明のリ ン脂質抗体結合用担体を使用する免疫学的 測定は抗リ ン脂質抗体症候群の診断の目的に使用するこ とができる。 こ こで抗リ ン脂質抗体症候群とは自己免疫 疾患 （全身性エリ テマ トーデス （ S L Ε ) 、 習慣性流産 など） のうち、 その患者の体液中に抗リ ン脂質抗体が出 現する疾患をいう。 このような疾患は結核性镟膜炎、 梅 毒などその体液中に抗リ ン脂質抗体が出現する感染性の 疾患とは区別される。
    [0106] 本発明の免疫学的測定法は、 このような感染性疾患に 由来する抗リ ン脂質抗体から抗リ ン脂質抗体症候群に特 異的な抗体を区別して測定できるところに特徴を有する ものである。
    [0107] 5 . 免疫学的測定法
    [0108] 本発明の免疫学的測定法とは、 抗リ ン脂質抗体の測定 を目的とし、 上記のリ ン脂質抗体結合用担体及び 又は 一次反応の際に反応液中に本発明血液成分を存在させて 反応を行い、 抗原抗体反応に基づく方法であれば、 その 操作方法、 標識物質 （マーカー） 、 被標識物質、 担体、 B F分離法などの種類は問わない。 免疫学的測定法とし て知られている公知の方法から本発明の目的に適合する 方法を適宜選択することができる。
    [0109] 公知の免疫学的測定法としては以下の方法が知られて いる。
    [0110] 抗原抗体反応の反応様式による分類として、 競合反応 法と非競合反応法 （ィムノメ ト リ ックアツセィ ） が知ら れているが、 本発明においては非競合反応法が好ましい。
    [0111] 検出方法による分類として、 抗原抗体反応の結果を直 接検出する非標識法 （ネフヱロメ ト リーなど） と、 なん らかのマーカーを使用して検出する標識法が知られてい るが、 本発明ではいずれの方法によってもよい。 測定感 度などを考慮すると、 特に標識法が好ましい。 なお、 標 識法において使用される標識物質 （マーカー） について は後に説明する。
    [0112] B F分離を行う必要のあるへテロジニァス法と必要の ないホモジニァス法が知られており、 本発明にはいずれ の方法を適用してもよい。
    [0113] 反応相による分類として、 全反応が液相で行われる液 相法と免疫反応の相手を固相化して反応を行う固相法が 知られているが、 本発明においては前記の担体物質とし て反応液可溶性の物質を使用する場合が液相法に相当し、 反応液不溶性の物質を使用する場合が固相法に相当する。
    [0114] 以上、 公知の免疫学的測定と本発明との閬係を説明し たが、 一般的方法については以下の文献に詳細に記載さ れている。
    [0115] ①入江 寛編 「続 ラ ジオィ ムノアツセィ 」 （㈱講談社、 昭和 5 4年 5月 1 日発行）
    [0116] ②石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （㈱医学 書院、 1 9 8 2年 1 2月 1 5 日発行）
    [0117] ③臨床病理 臨時増刊 特集第 5 3号 「臨床検査のため のィ ムノ ア ッ セィ 一技術と応用一」 （臨床病理刊行会、 1 9 8 3年発行）
    [0118] ④ 「バイ オテク ノ ロ ジ一事典」 （睐シーエム シー、 1 9
    [0119] 8 6年 1 0月 9 日発行）
    [0120] ⑤ 「Methods in ENZYMOLOGY 」 Vol.70
    [0121] ( Immunochemical techniques (Part A) )
    [0122] ⑥ 「Methods in ENZYMOLOGY 」 Vol.73
    [0123] ( Immunochemical techniques (Part B) )
    [0124] ⑦ 「Methods in ENZYMOLOGY 」 Vol.74
    [0125] ( Immunochemical techniques (Part C) )
    [0126] ⑧ ethods in ENZYMOLOGY j Vol.84
    [0127] ( Immunochemical techniques (Part D：
    [0128] Selected Immunoassay) )
    [0129] ⑨ fMethods in ENZYMOLOGY 」 Vol.92
    [0130] ( Immunochemical techniques (Part E:
    [0131] Monoclonal Antibodies and General
    [0132] Immunoassay Methods) )
    [0133] [⑤〜⑨はァカデミ ックブレス社発行] 以下、 本発明の免疫学的測定法を具体的に説明する。 5 . 1 被検液
    [0134] 本発明の免疫学的測定法 （以下、 本発明方法という場 合もある。 ） によって抗リ ン脂質抗体の存在またはその 含有量を測定する対象である被検液とは、 ヒ トを舍む動 物の体液である。 ここで体液とは、 血液、 血清、 腹水、 リ ンパ液、 関節内液もしく はこれらから得られた分画成 分、 またはその他の生体由来の液性成分をいう。
    [0135] また、 被検液を希釈液で適当な抗体価となるように希 釈してもよい。 このような希釈液としては、 例えばナ ト リ ウム系、 カ リ ウム系またはナ ト リ ウム一カ リ ウム系の リ ン酸緩衝生理食塩水 （ P B S ) 、 グッ ドの緩衝液 （例 えば、 N— 2 —ヒ ドロキシェチルビペラジン一 N ' — 2 —エタ ンスルホン酸 （ H E P E S ) 、 N— トリ ス （ヒ ド 口キ シメ チル） メ チルー 2—ア ミノ エタ ンスルホ ン酸
    [0136] ( T E S ) 、 3 — ( N—モルホリ ノ ） ブロノヽ'ンスルホン 酸 （M O P S ) などの緩衝剤を舍む緩衝液） 、 ダリ シン 緩街食塩水、 ベロナ一ル锾衝食塩水などの緩衝液が好ま しい。
    [0137] 5 . 2 第 1 の抗原抗体反応 （ 1次反応） 工程
    [0138] 本発明において 「第 1 の抗原抗体反応工程」 とは抗リ ン脂質抗体結合用担体と被検液とを接触させて被検液中 の抗リ ン脂質抗体と担体上のリ ン脂質との免疫複合体を 形成させる工程をいう。
    [0139] 本発明方法は、 前記処理物質を使用して処理されてい る抗リ ン脂質抗体結合用担体を使用し、 及び 又はこの 工程において反応液中に被検液と同種もしく は類縁の動 物に由来する血清もしく は血漿を存在させ、 あるいはそ の分画物あるいは精製されたその分画物中の蛋白質を存 在させて反応を行う ことに特徴がある。 このような方法 を採用するこ とによって抗リ ン脂質抗体結合用担体に感 染症に由来する抗リ ン脂質抗体が結合することを防止で き、 抗リ ン脂質抗体症候群に特異的に存在する抗体を担 体に特異的に結合させることができる。
    [0140] この工程は、 被検液として抗リ ン脂質抗体症候群患者 の体液または既知濃度の抗リ ン脂質抗体を舍む標準試薬 を抗リ ン脂質抗体結合用担体と一定時間 （例えば、 数十 分〜数時間） 、 反応を阻害しない温度条件下 （例えば、 0〜 5 0て） で接触させることによって行う ことができ る。
    [0141] 1次反応の際には前記の精製血清アルブミ ンを添加し て 1次反応を実施することができる。 この際に用いる精 製血清アルブミ ンは 5 %以下、 特に 1 %以下の濃度で用 いるのが好ましい。
    [0142] 通常は 1次反応工程終了後、 適当な分離手段によって、 抗リ ン脂質抗体と 免疫複合体を形成した抗リ ン脂質抗 体結合用担体と、 被検液とを分離する。 適用できる分離 手段は使用する担体物質の種類に依存するが、 反応液不 溶性の担体物質を使用する場合は、 吸引、 傾寫、 據過、 遠心分離など公知の方法によって分離することができる。 分離後、 抗リ ン脂質抗体結合用担体を緩衝液などで洗浄 してもよい。
    [0143] なお、 1次反応工程と後述する 2次反応工程を同時に 行ってもよ く、 または 1次反応工程後、 被検液を分離す ることな く、 引続き行ってもよい。
    [0144] 5 . 3 分画物及び蛋白質
    [0145] 1次反応工程で使用する 「被検液と同種の動物に由来 する血清、 血漿」 は、 その体液中の抗リ ン脂質抗体を測 定すべき動物と同種の動物 （類縁種も舍む） の血液から 公知の方法によって製造されたものであればよい。 例え ば、 ヒ トの体液を測定対象とする場合にはヒ ト血清また はヒ ト血漿が使用され、 特に健常人の血清または血漿が 好適である。 また、 その分画物とは例えばヒ ト血清また はヒ ト血漿を公知の分離精製法 （ゲル濾過 （分子ふるい クロマ トグラフィー） ； D E A E—セルロースなどを用 いるイ オン交換ク ロマ トグラフ ィー ； プロティ ン Aセフ ァ ロース、 ぺパリ ンセファ ロース、 カルジオリ ビンーポ リ アク リルァ ミ ドなどによるァフ ィ 二ティークロマ トグ ラフィー ； カルジオリ ビン等のリ ン脂質を舍むリ ポソ一 ムによるァフィ二ティー吸着 ； 透折、 限外濾過などによ る膜分離； 電気泳動 ；溶媒抽出など） によって分面した ものであって、 本発明方法の 1次反応工程において、 反 応液中に添加することによって、 抗リ ン脂質抗体症候群 に特異的に存在する抗体と担体に結合したリ ン脂質との 結合性を高める効果を示す画分である。 上記の血清もしく は血漿の分画物としては、 例えば、 ヒ ト血清もし く は血漿を、 例えばウルトロゲル A C A— 3 4 ( L K B社製） カラムを用いてゲル濾過し、 抗リ ン 脂質抗体症候群の患者血清中に特異的に存在する抗体と リ ン脂質との結合性を高める作用を示す酉分を採取する ことによって得られるものが挙げられる。
    [0146] あるいは、 以下に示す理化学的性質を有する分画物が 挙げられる。
    [0147] ①分画分子量 6 ,00 0〜 8 ,00 0のセルロース膜を用い て透折すると非透析画分に含まれる。
    [0148] ②ゲル濾過または S D S—ボリ ァク リルァ ミ ドゲル電気 泳動によつて分画すると血清アルブミ ンの近傍か、 僅か に低分子側に確認される。
    [0149] ③ブロティ ン Aと結合しない。
    [0150] ④ジェチルア ミノエチル基を舍む弱塩基性陰イオン交換 体によるク ロマ トグラフィーにおいて I g G画分の近傍 に溶出される。 例えば、 D E A E—セルロースカラムに よるクロマ トグラフィーにおいて、 0.01 4 M リ ン酸 緩衝液 （ P H 7.4) で溶出すると素通りする画分で I g G画分の近傍かより僅かに遅れて溶出される。
    [0151] ⑤ 3 0〜 6 0 %飽和硫酸ァンモユウムで塩折される画分 に舍まれる。
    [0152] 上記の血清、 血漿その分画物もしく はその分面物中の 下記の蛋白質の前記した抗原抗体反応液中での濃度は前 記のような本発明の効果が達成できる程度に高濃度であ れば特に限定されない。 血清もしく は血漿を、 例えば血 液から通常の方法によって調製された血清もしく は血漿 を約 2 0 0倍に希釈した濃度以上、 特に約 4 0倍に希釈 した濃度以上 （分画物、 下記の蛋白質の場合は、 血清ま たは血槳の上記希釈度に相当する濃度以上） の高濃度に 反応液中に存在させることが好ましい。
    [0153] 高濃度の血清、 血漿その分画物もしく はその分画物中 の蛋白質を反応中に存在させることは、 抗リ ン脂質抗体 症候群の患者血清中に特異的に存在する抗体リ ン脂質と の結合性を高める作用を有し、 他方、 結核性髄膜炎、 梅 毒などの感染症患者血清中に存在する抗リ ン脂質抗体と リ ン脂質との反応を抑制する作用を有する。
    [0154] 上記分面物の活性成分である蛋白質は以下のようにし て均質な蛋白質として単離精製することができる。
    [0155] 先ず、 健常人の血清もしく は血漿を、 例えば D E A E
    [0156] —セルロースなどを用いたイオン交換カ ラムク ロマ トグ ラフィ一に付し、 活性成分を舍有する画分を採取する。 活性画分は、 抗リ ン脂質抗体症候群の患者血清中に特異 的に存在する抗体とリ ン脂質との結合性を高める作用を 指標として採取する。
    [0157] 次いで得られる活性画分をプ口ティ ン A—セルファロ ースカラムクロマ トグラフィーに付して、 活性画分に舍 有するヒ ト I g Gを取り除く。 更に抗ヒ ト I g G抗体を 例えば、 セフ ァ ロース C L 一 4 B樹脂 （フ アルマシア社 製） に結合して調製したカラムを用いるァフィ二ティー カラムク ロマ トグラフィ一に付して、 ブロティ ン A非吸 着性の人ヒ ト I g Gを取り除く。
    [0158] 尚、 上記の各カラムクロマ トグラフィーに付した後に 得られる各活性画分は、 必要に応じて常法により透折し、 また限外濾過器もし く は飽和硫酸ァンモニゥムによる塩 折により適宜濃縮してもよい。
    [0159] 次いで、 ヒ ト I g Gが取り除かれた精製画分と、 リ ポ ソームとを接触させて活性成分をリ ボソームに吸着させ て活性成分を精製する。 ここで用いる リ ボソームは、 力 ルジオリ ビン、 ホスファ チジルセリ ン、 ホスファ チジル イ ノ シ トール、 ホスファ チジン酸などの式 [ I ] で表わ される リ ン脂質からなるリ ポソーム、 あるいは該リ ン脂 質を 1つの構成成分とするリ ボソームである。 リ ポソ一 ムの調製は常法 [免疫実験操作法 K , 第 2 9 8 9— 2 9 9 4頁、 昭和 5 5年 1 2月 4 日、 日本免疫学会発行] に より行う ことができる。 例えば、 カルジオリ ビンのアル コール溶液を梨型フラスコに取り、 減圧乾固し、 これに 適当な緩衝液を加えてボルテックスミキサーにより激し く撹拌してカルジオリ ビン · リ ポソームを調製すること ができる。
    [0160] リボソームを舍む緩衝溶液に活性成分を舍む画分を加 えて活性成分をリボソームに吸着させ、 次いで活性成分 が吸着されたリ ボソーム懸濁液を遠心分離に付し、 得ら れる上清より精製された活性成分が回収される， 活性成 分は更に H P L Cなどのクロマ トグラフィーに付して更 に精製してもよい。
    [0161] かく して得られる精製された活性成分は以下の理化学 的性質を示す。
    [0162] ① S D Sポリアク リ ルアミ ドゲル電気泳動により測定さ れる分子量が約 5 0 , 0 0 0 ± 2 , 0 0 0で等電点が約 6 . 6
    [0163] 0 ± 0 . 4であり、
    [0164] ②リ ン脂質に対して結合性を有する。
    [0165] 活性成分は、 特に陰性荷電をもつカルジォリ ピンなど のリ ン脂質に対して特異的な結合性を示す。 また、 抗リ ン脂質抗体症候群に特異的に存在する抗体、 例えば自己 免疫疾患患者中の抗カルジオリ ビン抗体と、 担体に結合 した力ルジォリ ビンとは、 本活性成分に依存的に反応す る。
    [0166] ③結核性髄膜炎、 梅毒などの感染症由来の抗リ ン脂質抗 体とリ ン脂質との反応性を抑制する作用を有する。
    [0167] これらの性質から、 担体に結合したカルジォリ ピンと 抗リ ン脂質抗体症候群に特異的に存在する抗体とを舍有 する反応系に上記活性成分を添加した場合には、 先ず、 活性成分と担体に結合したカルジォリ ビンとが反応して 複合体を形成し、 これに抗リ ン脂質抗体症候群に特異的 な抗体が結合するものと考えられる。
    [0168] また、 上記②及び③の性質を有することから、 後述す る如く、 本活性成分を用いて抗リ ン脂質抗体症候群由来 の抗リ ン脂質抗体と感染症由来の抗リ ン脂質抗体とを分 别検出することができる。 尚、 高濃度の血清もしく血漿、 あるいはその分画物を反応液中に存在させても同様に分 別検出することができる。
    [0169] 本発明で得られる上記の活性成分蛋白質を、 前記した 第 1 の抗原抗体反応の際に添加することにより、 抗リ ン 脂質抗体症候群に特異的に存在する抗体を、 選択的に検 出することが可能となる。
    [0170] 5 . 第 2 の抗原抗体反応 （ 2次反応） 工程
    [0171] 本発明において 「第 2の抗原抗体反応工程」 とは、 1 次反応工程で形成された免疫複合体と標識抗ィムノグロ ブリ ン抗体とを反応させて該免疫複合体と標識抗ィムノ グロプリ ン抗体とからなるサ ン ドィ ツチ状 ¾ .疫複合体を 形成させる工程をいう。
    [0172] この工程で使用される標識抗ィムノグロプリ ン抗体は、 抗ィ ムノグロプリ ン抗体が後で説明する検出工程の検出 方法に対応する適当なマーカーで標識されたものである。
    [0173] ここで使用される抗ィ ムノグロプリ ン抗体とは、 測定 すべき抗リ ン脂質抗体と結合できる抗体またはそのフ ラ グメ ン 卜であれば、 その由来、 製法には特に限定されな い 0
    [0174] 通常、 体液中の抗リ ン脂質抗体のサブクラスは I g G、
    [0175] I g M、 I g Aなどであるので、 抗ィムノグロブリ ン抗 体は抗 I g G抗体、 抗 I g M抗体、 抗 I g A抗体などか ら目的に応じて適宜に選択し得る。 また、 測定すべき抗 リ ン脂質抗体がヒ ト由来のものである場合は、 抗ヒ トイ ムノグロプリ ン抗体が使用されることはいうまでもない。 このような抗ィムノグロプリ ン抗体の調製は、 測定す べき抗リ ン脂質抗体を産生する動物と同一種の動物由来 のィムノグロブリ ンを他の動物に投与して免疫し、 その 動物の血清から分離精製する方法、 またはその動物の抗 体産生細胞 （脾細胞、 リ ンバ節細胞、 末梢血リ ンバ球な ど） をハイブリ ドーマ法、 ト ラ ンスフォーメーショ ン法 ( E Bウィ ルスなどによる） など公知の方法 （例えば、 Eur.J. Immunol., JB_, 511 (1976)など参照） で半永久 的に増殖可能とし、 この細胞を in vitro (試験管内） もしく は in vivo (生体内） で増殖させた培養物から分 離精製する方法によって行う ことができる。 これらの抗 ィムノ グロプリ ン抗体は市販されており、 本発明方法に はこのような当業者が容易に入手できる抗体を使用する ことができる。
    [0176] また、 抗ィ ムノ グロプリ ン抗体は抗体分子をそのまま 使用してもよ く、 蛋白分解酵素 （例えば、 パパイ ン、 ぺ プシンなど） などで分解して抗体フラグメ ン ト （ F ( a b，）2 , F a b ' など） として使用してもよい。
    [0177] 抗ィ ムノグロプリ ン抗体を標識する標識物質 （マーカ 一） は、 検出工程に対応するものであれば特に限定され ない。 例えば、 放射性同位元素 （125I、 131I、 3H、 14 Cなど）、酵素 （ペルォキシダーゼ、 ーガラク トシダ ーゼ、 アルカ リホスファターゼ、 グルコースォキシダー ゼ、 グルタ ミ ン酸ォキシダーゼ、 グルコース一 6 —リ ン 酸デヒ ドロゲナーゼ、 リゾチーム、 ダルコアミラーゼ、 アセチルコ リ ンエステラーゼ、 マイ レン酸デヒ ドロゲナ ーゼなど）、その他の生体内リガン ド · レセプター （ビォ チン、 アビジン、 ス ト レプ トアビジンなど） 、 補酵素 ' 補欠分子族 （ F AD、 FMN、 AT Pなど） 、 蛍光物質 (フルォロセイ ンイ ソチオシァネー ト （ F I T C ) 、 ュ 一口ピウム、 フィコヱリ ト リ ンなど） 、 発光物質 （ルミ ノール誘導体など） 、 電子ス ピン共鳴 （E S R ) 用マー 力一物質 （ビペリ ジン一 1 _ N—ォキシル化合物、 ビ口 リ ジン一 1 一 N—ォキシル化合物など） 、 リ ポソーム (酵素、 蛍光物質、 発光物質などの標識物質を舍有する） など公知のマーカーで標識することができる （前記文献 ①、 ②、 ④参照） 。
    [0178] 抗ィ ムノグロプリ ン抗体をこれらのマーカ一で標識す る方法も公知技術によって行う ことができる。 例えば、 放射性同位元素をマーカーとして使用する場合には、 ク 口ラ ミ ン T法、 ラク トペルォキシダーゼなどを用いる酵 素法、 ボル ト ン一ハンター （ Bol ton-Hunter )法などに よって行う ことができる （前記文献①参照） 。 また、 例 えば酵素をマーカーとして標識する場合は、 マレイ ミ ド 架橋法 （例えば、 サクシミ ジル 6—マレイ ミ ドへキサ ノエー ト （EM C S ) を使用する。 ） 、 ダルタルアルデ ヒ ド架橋法、 過ヨウ素酸架橋法 （中根法） 、 イ ソ シァネ 一ト架橋法 （例えば、 イ ソ シァネー ト類 （ トルエンジィ ソ シァネー ト など） 、 イ ソチオシァネー ト類を使用す る。 ） 、 ベンゾキノ ン架橋法によつて行う ことができる (前記文献①、 ②参照） 。
    [0179] この 2次反応工程を 1次反応工程と分離して行う場合、 1次反応工程によって得られた免疫複合体が結合した抗 リ ン脂質抗体結合用担体と標識抗ィムノ グロブリ ン抗体 を舍有する溶液 （緩衝液などの溶液） とを一定時間 （例 えば、 数十分〜数時間） 、 反応を阻害しない温度条件下 (例えば、 0〜 5 0て） で接触させることによって反応 を行う ことができる。
    [0180] また、 1次反応工程と同時、 または反応液を分離する ことな く引続き反応を行う場合には、 1次反応を行う と き、 または反応終了後、 反応液中に標識抗ィムノ グロブ リ ン抗体を存在させればよい。
    [0181] 5 . 5 B F分離工程
    [0182] 本発明方法の B F分離工程は、 2次反応工程において 形成されたサン ドィ ツチ状免疫複合体を舍む相と担体に 結合しなかった物質を舍む相とを分離する分離工程であ る。
    [0183] 本発明方法をホモジニァス法で行う場合はこの工程は 必要ないが、 ヘテロジニァス法で行う場合は必須の工程 である。
    [0184] この工程は、 反応液不溶性の担体物質を使用する場合 は、 吸引、 傾寫、 濾過、 遠心分離など公知の分離手段に よって行うことができる。
    [0185] 上記の分離操作後、 または同時に緩衝液 （ P B Sなど） で担体を洗浄してもよい。 5 . 6 検出工程
    [0186] 本発明方法の Γ検出工程」 とは、 ヘテロジニアス法の 場合上記 B F分離工程において分離されたサン ドィ ツチ 状免疫複合体に舍まれる標識抗ィムノ グロプリ ン抗体の または該複合体を形成しなかった標識抗ィムノ グロプリ ン抗体の標識物質 （マーカー） を検出する工程をいう。 この検出は定量的であっても、 定性的であってもよい。 検出工程は、 使用するマ一カーに対応するものであれ ばよ く、 公知の方法によって行える （前記文献①〜⑨参 照） 。 例えば、 放射性同位元素をマーカーとして用いた 場合にはシンチレーシヨ ンカウンターによって、 酵素を マーカーとして用いた場合には使用する酵素の活性測定 に使用される公知の方法によつて検出を行う ことができ る。
    [0187] 以下、 ペルォキシダーゼをマーカーとして用いた場合 の酵素活性の測定について説明する。
    [0188] ペルォキシダーゼ活性の測定は、 基質である過酸化水 素が水に分解される際の電子の授受を検出する各種の方 法で行う ことができる。 すなわち、 例えば色原体 （ Chr omogen )の酸化に基づく吸光度の変化の測定、 酸化還元 電位の変化の電極による測定など公知の方法を利用する ことができる。 特に、 色原体を使用する方法が一般的で ある。 色原体としては、 例えばテ トラアルキルべンジジ ン （ 3 , 3 ' , 5 , 5 ' —テ ト ラメ チルベンジジン （ T M B Z ) など） 、 0 —フエ二レンジァ ミ ン （ O P D ) 、 2 , 2 ' —アジノ ジ （ 3 —ェチル） ベンゾチアゾリ ノ ン — 6 —スルホン酸 （ A B T S ) 、 ジァニシジン、 ジカル ボキシジン、 ジァ ミノベンジジンなど公知の物質を使用 することができる （例えば、 特公表昭 6 2 — 5 0 2 6 5 3 ( W 0 8 6 / 0 4 6 1 0 ) 参照） 。
    [0189] ペルォキシダーゼ活性の色原体を使用する測定は、 B F分離によって分離されたいずれかの相に過酸化水素お よび色原体を舍有する溶液 （好ましく は、 緩衝液 （クェ ン酸緩衝液、 酒石酸緩衝液、 P B Sなど） の溶液） を添 加して一定時間 （例えば、 数分〜数時間） 、 常温下 （例 えば、 室温下） で反応し、 酵素反応停止液 （例えば、 硫 酸） によって反応を停止した後、 吸光度 （T M B Zの場 合は 4 5 0 n mにおける吸光度） を測定することによつ て行う ことができる。 なお、 被検液中の抗リ ン脂質抗体 の定量は、 既知濃度の抗リ ン脂質抗体を舍有し、 例えば 被検液と同種もしく は類緣の動物に由来する血清、 血漿 その分酉物もしく はその分面物中の蛋白質を添加した標 準試薬を使用して測定した標準曲線 （吸光度と抗体濃度 (または抗体価） との閬係を示す。 ） と、 測定された吸 光度を比較することによって行う ことができる。
    [0190] 5 . 1 分別検出
    [0191] 反応液中に高濃度の血清もしく は血漿、 その分酉物、 あるいはその分画物中の活性成分である蛋白質を存在さ せて抗リ ン脂質抗体症候群由来の抗リ ン脂質抗体と感染 症由来の抗リ ン脂質抗体との分別検出は以下のようにし て行なう ことができる。
    [0192] 即ち、 前記した抗原抗体反応 （ 1次反応） 工程におい て、 高濃度の血清もしく は血漿、 その分画物、 あるいは 蛋白質を存在させて 1次反応を実施する系と、 これらを 存在させないで 1次反応を実施する系の両者を実施する, そしてこれらの本発明血液成分を存在させることによつ て抗リ ン脂質抗体と担体に固定化されたリ ン脂質との反 応性が依存的に増強した場合には、 抗リ ン脂質抗体症候 群由来の抗リ ン脂質抗体と判断できる。 これらの本発明 血液成分を存在させることによって依存的に反応性が滅 少した場合には、 感染症由来の抗リ ン脂質抗体と判断で きる。
    [0193] 6 . キッ ト
    [0194] 6 . 1 キッ ト （ 6 )
    [0195] 上記 （ 4 ) の本発明方法に使用される免疫学的測定法 用キッ ト （ 6 ) は少なく とも前記 （A ) 〜 （ C ) の構成 試薬から構成される。
    [0196] 構成試薬 （A ) の 「抗リ ン脂質抗体結合用担体」 は、 前記 「 3 . 抗リ ン脂質抗体結合用担体」 で説明したもの のうち、 精製血清アルブミ ンと界面活性剤の二種を併用 して処理されたもの、 または精製血清アルブミ ン、 界面 活性剤および被検液と同種もしく は類縁の動物に由来す る血清、 血漿、 その分画物もしく はその分面物中の蛋白 質の三種を併用して処理されたものが使用される。 構成 試薬 （ B ) の Γ標識抗ィ ムノ グロブリ ン抗体 J は、 前記 「 5 . 3 第 2 の抗原抗体反応 （ 2次反応） 工程」 で説 明したものが使用される。 構成試薬 （ C ) の 「被検液 と同種の動物に由来する血清、 血漿もしく はその分画物 を添加した検体希釈液」 は測定すべき被検液もしく は標 準試薬を必要に応じて希釈するためのものであり、 上記 と同様の理由で本発明血液成分が添加されている。
    [0197] 本発明のキッ ト （ 6 ) には上記構成試薬の他に、 必要 に応じて標準試薬、 あるいは標識物質を検出するための 試薬を添付することができる。 標準試薬としては、 既知 濃度の抗リ ン脂質抗体を舍み、 必要に応じ本発明血液成 分を添加した標準試薬が例示される。 これは、 通常抗リ ン脂質抗体症候群の患者から分離された抗リ ン脂質抗体 を必要に応じて段階希釈したもので、 前記 「 5 . 2 第 1 の抗原抗体反応 ( 1次反応） 工程」 に説明した理由に より、 本発明血液成分を添加したものである。 標識物質 を検出するための試薬としては例えば、 キッ トが酵素免 疫学的測定法用のキッ トである場合には必要に応じて酵 素活性を測定するための試薬、 すなわち酵素の基質とそ の反応のィ ンディケータ （例えば、 前記 「 5 . 5 検出 工程」 の色原体） を添付することが好ましい。 また、 酵 素反応停止液 （例えば、 硫酸を舍む溶液） を添付しても よい。
    [0198] 6 . 2 キッ ト ）
    [0199] 上記 （ 5 ) の本発明方法に使用される免疫学的測定法 用キッ ト （ 7 ) 少なく とも前記 （ A ' ：) 〜 （ C ) の構成 試薬から構成される。 必要に応じてキッ ト （ 6 ) と同様 に、 標準試薬、 標識物質を検出するための試薬を添付す ることができる。
    [0200] 構成試薬 （Α ' ) は前記 「 3 . 抗リ ン脂質抗体結合用 担体」 で説明した抗リ ン脂質抗体結合用担体のう ち、 界 面活性剤だけで処理されたものである。 その他の構成試 薬は上記 6 . 1 と同様の試薬である。
    [0201] 6 . 3 キッ ト （ 1 4 )
    [0202] 上記 （ 1 2 ) の免疫学的測定法用に使用するキッ トは、 その構成試薬の 1つとして、 高濃度の血清もしく は血漿、 あるいは上記した分画物またはその分画物中の蛋白質を 舍む。 他の構成試薬は従来用いられているいずれの抗リ ン脂質抗体結合用担体でもよ く、 勿論、 上記した本発明 の抗リ ン脂質抗体結合用担体でもよい。 また他の構成試 薬も通常使用される試薬をそのまま用いることができる。 〔実施例〕
    [0203] 以下、 参考例および実施例を示し、 本発明をより具体 的に説明する。
    [0204] 参考例
    [0205] 従来法による一般的な操作法とそれによる測定例を以 下に示す。
    [0206] 牛 （ゥ シ） 心臓由来のカルジオリ ビン （シグマ社製） 5 0 μ g / m 1 のエタノール溶液を 5 0 it/ 1ノウエル ずつ 9 6 ゥヱルマイ ク ロタイ タープレー ト （ポリ スチレ ン ； タイターテック社製） の各ゥエルに入れ、 ゥエル中 のエタ ノ ールを減圧乾燥によ って乾燥した。 乾燥後、
    [0207] 1 0 %ゥシ胎児血清舍有リ ン酸緩衝生理食塩水 （ P B S ) (以下、 P B S— F B Sと略す。 ） （ P H 7.4) を 2 5 0 〃 1 Zゥュル加え、 室温で 1時間ブロ ッキングした後、 全ゥエルを 2 5 0 1 の 0.05 % ( V7V ) ト ウィーン
    [0208] 2 0 ( Tween 20, 商品名， キシダ化学㈱製） 舍有 P B S (以下、 P B S— T w e e nと略す。 ） で 3回洗浄し た。 次に被検液 （血清） の P B S— F B Sによる適宜希 釈液を 1 0 0 ti 1 ずつゥエルに入れ、 室温で 1時間反応 させ、 P B S— T w e e n 2 5 0 1 で 5回洗浄した。 西洋ヮサビペルォキシダーゼ標識抗ヒ ト I g G抗体を
    [0209] 1 0 0 μ 1 ずつ各ゥヱルに加え、 室温で 1時間反応させ、 P B S— T w e e nで 5回洗浄した。 基質溶液 （0.003 %過酸化水素水を舍む 0.3mM 3 , 3 ' , 5 , 5 ' — テ ト ラメ チルベンジジン （ TM B Z ) 溶液） 1 0 0 1 を加え、 室温で 1 5分反応させた後、 反応停止液 （ 2 N 硫酸） 1 0 0 1 を反応液に加え、 吸光度 U50nra)を測 定した。 その結果を第 1図 （A) に示す。 なお、 使用し た酵素標識抗体は過ヨウ素酸架橋法で西洋ヮサビペルォ キシダーゼとマウスモノ ク ローナル抗ヒ ト I g G抗体
    [0210] ( G— 0 2 , I g Gク ラス ； ャマサ醤油㈱製） を結合し たものである。 なお、 ここで用いた被検液 A s血清は典 型的な抗リ ン脂質抗体症候群 （ S L Eで習慣性流産） の 患者血清 （以下、 A s血清という。 ) で、 被検液 Y a血 清は全く抗リ ン脂質抗体症候群の兆候のない結核性髄膜 炎患者の血清である （以下、 Y a血清という。 ） 。 1次 反応においてゥシ胎児血清 （ F B S ) を用いる従来法で は第 1図 （A ) のとおり Y a血清中の抗体 （以下、 Y a 抗体という。 ） と A s血清中の抗体 （以下、 A s抗体と いう。 ） を分別定量することは不可能であった。
    [0211] 実施例 1 健常人血清添加による抗リ ン脂質抗体症候 群特異的抗体の検出
    [0212] ( 1 ) 抗リ ン脂質抗体結合用担体の作成
    [0213] 抗リ ン脂質抗体結合用担体は以下の 2種類の方法を用 いて作成した。
    [0214] [方法 ( I ) ]
    [0215] ゥ シ心臓由来のカルジオリ ビン （シグマ社製） 5 0 〃 g /m 1 のエタノール溶液を 5 0 μ 1 /ゥヱルずつ 9 6 ウェジレマイ ク ロタイ タープレー ト （ボリ スチレン ； タイ ターテ ック社製） の各ゥヱルに入れ、 ゥヱル中のエタノ
    [0216] —ルを減圧乾燥によって乾燥した。 次いで、 1 % ( W/ V ) 精製牛 （ゥ シ） 血清アルブ ミ ン （シグマ社製 ； o. 7511, Fatty acid- free;以下、 p B S Aと略す。 ) を舍 有する P B S ( p H 7 .4) (以下、 P B S— p B S Aと 略す。 ） 2 5 0 1 を入れ、 4てで 1時間処理し、 0.05
    [0217] % ( V/V ) トウィーン 2 0含有 P B S ( P B S— T w e e n ) 2 5 0 // 1 で 3回洗浄して本発明の抗リ ン脂 質抗体結合用担体を得た。
    [0218] [方法 （ Π ) ]
    [0219] ゥ シ心臓由来のカルジオ リ ビン （シグマ社製） 5 0 0 g /m l のェタノール溶液をガラス試験管に入れ、 減 圧下で乾燥した後、 P B Sを加え、 カルジオリ ビンを懸 濁させた。 このカルジオリ ビン懸濁液を 5 0 1ノウェ ルずつ 9 6 ゥヱルマイ ク ロタイ タープレー ト （ボリ スチ レン ； タイ ターテック社製） の各ゥヱルに入れ、 4てで
    [0220] 1時間反応させ、 懸濁液を吸引除去した。 以後は方法 ( I ) と同様の操作で本発明の抗リ ン脂質抗体結合用担 体を得た。
    [0221] ( 2 ) 抗リ ン脂質抗体の測定
    [0222] 参考例で使用したものと同じ患者血清 （A s血清およ び Y a血清） のそれぞれに健常人血清 5 %を添加し、 P B S— p B S Aで希釈した。 この希釈液をそれぞれ 1 0
    [0223] 0 1 ずつ、 方法 （ I ) および方法 - ( Π ) で作成した力 ルジオリ ビン結合タイ ターブレー トに添加し、 4てで 1 時簡反応させ、 P B S— T w e e n 2 5 0 ^ 1 で 5回 洗浄した。 以後の反応は参考例と同様の操作を行って吸 光度を測定した （本発明方法） 。 なお、 方法 （ I ) で作 成したプレー トについては 1次反応において P B S Aを 添加して反応を行った他は上記と同様に操作し、 吸光度 測定した （比較実験） 。 それぞれの方法によって得られ た結果を希釈曲線として示した。 第 1図 （ B ) は比較実 験の結果を、 第 1図 （ C ) は方法 （ I ) で作成したプレ ー トについて行った本発明方法の結果を、 第 2図は方法 ( Π ) で得られたプレー トについて行った本発明方法の 結果をそれぞれ示す。 第 1図 （ B ) から明らかなように本発明によるカルジ ォリ ビン結合プレー トを使用し、 参考例の 1次反応系に 用いているゥシ胎児血清 （ F B S ) を市販の精製ゥシ血 清アルブミ ン （ p B S A) に置き換えること （比較実験） で、 Y a血清中の抗カルジオリ ビン抗体 （ Y a抗体） の 結合性が有意 （ 2 0 %程度まで） に低下した。 A s抗体 に関しても希釈度の高い検体 （つまり、 2 0 0倍以上の 希釈液） で結合活性の消失が認められた。 P B S Aを 1 次反応において添加した比較実験の基本測定系に更に健 常人血清 （ 5 %程度） を加えることで A s抗体価だけが ゥシ胎児血清 （ F B S ) を用いた従来法 （参考例） と同 程度にまで回復し、 Y a抗体価に関しては完全に消失し た。
    [0224] なお、 一次反応において添加する健常人血清の濃度を 変化させて上記と同様に反応を行い、 A s血清の抗体価 を測定したところ、 特に希釈度 1 4 0以上の高濃度に 健常人血清を添加した際に十分な吸光度が得られた （第 3図） 。 なお、 測定したサンプルは、 2 4ユニッ ト （ 2 4 U ) と 1 2ユニッ ト （ 1 2 U ) (ハリ スらのユニッ ト による） の A s血清である。
    [0225] 実施例 2 健常人血清分面添加による抗リ ン脂質抗体 症候群特異的抗体の検出
    [0226] 健常人血清をゲル濾過によって分面し、 その各面分を 1次反応の反応液に添加した。 カルジオリ ビン結合プレ 一トは実施例 1 の方法 （ I ) で作成したものを使用し、 健常人血清をそのゲル濾過による画分に代えた他は実施 例 1 と同様の操作で抗体価の指標としての吸光度 U50nm) を測定した。 健常人血清の分画は、 P B S ( p H 7.4) であらかじめ平衡化したウルトロゲル A C A— 3 4 ( L K B社製） カラム （ 2.OX 5 5 on) で 3 m l の健常人 血清をゲル濾過し、 2 m 1 ずつ分取することによって行 つた。 第 4図にウルト ロゲル A C A— 3 4によるゲル濾 過のパターンと A s血清および Y a血清の上記方法によ つて得られた抗体価の指標としての吸光度 U50nm)との 関係を示す。 その結果、 第 4図の 3本の 2 8 0 n mの 収ビークのうち 2番目に出現するビークの画分に A s抗 体の結合性を高め、 Y a抗体の結合を消失せさる効果を 有す 成分 （以下、 本活性成分という こともある。 ） が 存在することが確認された。 この画分には血清アルブミ ンも舍まれるが、 精製ヒ ト血清アルブミ ン自身にはそれ らの活性 （効果） は認められなかったことから血清アル ブミ ンによる効果ではないことが確認された。
    [0227] また、 健常人血清を G 2 0 0 0 S W (東ソ一㈱製） 力 ラム （ 0.75 X 3 O cia) を用いた H P L C法によるゲル 濾過で分面したところ、 本活性成分を舍有する画分 （活 性ビーク） は血清アルブミ ン画分付近に出現し、 僅かに 低分子側に溶出された （第 5図） 。
    [0228] 次に健常人血清を 1 M ト リ スー塩酸緩衝液 （ p H 9.0) で透折した後、 プロテイ ン A—セファ ロース （フアルマ シァ社製） カラムに通し、 素通り画分 （非 I g G画分） および 0.1Mクェン酸緩衝液 （ P H 3.0) で溶出する画 分 （ I g G画分） を調製した。 第 6図に、 その溶出バタ ーンを示す。 また、 各画分を P B Sで透折した後、 その 1 / 2 0血清濃度相当量を A s血清 （ 2 4 U ) に添加し. 方法 （ I ) で作成したプレー トを用いて実施例 1 と同様 の方法で抗体価の指標としての吸光度（450nw) を測定し た。 その結果を第 1表に示す。
    [0229] 第 1表 吸光度 (450nm) 非 I g G画分 1 .15 4
    [0230] ( 0.02 2 )
    [0231] I g G画分 0.80 6
    [0232] ( 0.67 6 ) なお、 表における数値は 4 5 0 n mにおける吸光度を 表す。 また、 括弧中の数値は A s血清を舍まない検体に ついて測定した結果を示す （対照試験） 。
    [0233] 第 1表に示すとおり、 本活性成分は非 I g G画分に存 在する。
    [0234] さらに、 健常人血清を、 D E A E—セルロース （ヮ ッ トマン社製、 D E— 5 2 ) に通したところ、 本活性成分 は、 0.01 4 Mリ ン酸緩衝液 （ P H 7.4) で溶出される 素通り画分に現れ （第 7図） 、 また硫酸ア ンモニゥムを 用いて塩折したところ、 本活性成分は 3 0〜 6 0 %飽和 濃度で沈殺した （第 8図） 。
    [0235] なお、 A s抗体の結合を高める効果は、 上記成分と固 相化カルジオリ ビン * ミセルとの相互作用によって現れ、 Y a抗体の結合を消失させる効果は液相中で因子が抗体 と反応し吸収されることによると考えられる。
    [0236] 実施例 3 界面活性剤処理抗原結合担体による抗リ ン 脂質抗体症候群特異的抗体の検出
    [0237] 基本的には実施例 1 ( 1 ) の方法 （ I ) および方法 ( Π ) に準じて トウ ィ ー ン 2 0だけによつて処理され た抗リ ン脂質抗体結合用担体を使用し、 本発明方法の効 果を調べた。
    [0238] すなわち、 方法 （ I ) に従ってゥシ心臓カルジオリ ビ ンを 9 6 ゥヱルマイ ク ロタイ タープレー トの各ゥヱルに 結合させた。 このゥエルを 0 . 0 5 % P B S— T w e e n で洗浄し、 実施例 1 と同様に 1次反応の反応液に健常人 血清を添加し （実験 I 一 1 ) 、 または無添加で （実験 I 一 2 ) 反応させ、 以後は実施例 1 と両様に操作し、 抗体 価の指標としての吸光度 50nm)を測定した。 また、 同 一の方法でカルジオリ ビ ンを結合させたゥュルを、 ト ウ ィ ー ン 2 0を舍まない P B Sで洗浄し、 1次反応の反 応液に健常人ヒ ト血清を添加し （比較 I — 1 ) 、 または 無添加で （比較 I 一 2 ) 反応させ、 以後は実施例 1 と同 様に操作し、 抗体価の指標としての吸光度 （450ηιη)を測 定した。 なお、 1次反応工程後および 2次反応工程後の 洗浄は、 それぞれの実験区とも上記の洗浄液にそれぞれ 対応するものを使用した。
    [0239] また、 試験管中に乾固したカルジォリ ビンを 0.01 % B S Aを舍有する P B S ( H 6.0) で懸濁する他は前 記方法 （ II ) と同様の操作でゥ シ心臓カルジォリ ビンを
    [0240] 9 6 ゥ Λルマイ クロタイ タープレー トの各ゥヱルに結合 させた。 この エルを 0.05 % P P B S— T w e e nで 洗浄し、 実施例 1 と同様に 1次反応の反応液に健常人ヒ ト血清を添加し （実験 Π— 1 ) 、 または無添加で （実験 U — 2 ) 反応させ、 以後は実施例 1 と同様に操作し、 抗 体価の指標としての吸光度 （ 450nn を測定した。 また、 同一の方法でカルジォリ ピンを結合させたゥヱルを、 ト ウ ィ ー ン 2 0を舍まない P B Sで洗浄し、 1次反応の 反応液に健常人血清を添加し （比較 Π— 1 ) 、 または無 添加で （比較 Π — 2 ) 反応させ、 以後は実施例 1 と同様 に操作し、 抗体価の指標としての吸光度 （450nm)を測定 した。 なお、 1次反応工程後および 2次反応工程後の洗 浄とは、 それぞれの実験区とも トウ ィ ー ン 2 0を舍ま ない P B Sを使用した。
    [0241] また、 上記の実験はいずれも被検液として、 A s血清 および Y a血清を使用した。 なお、 これらの血清は、 ハ リ ス （ Harris, E.N. ) らによって第 3回キングス ト ン 抗リ ン脂質抗体シンポジウム （ KA P S ) で提唱された 抗リ ン脂質抗体価が一定となるように希釈されたもので ある。 これらの実験の結果を第 2表に示す。
    [0242] なお、 表における数値は 4 5 0 n mにおける吸光度を 表す。 また、 括弧中の数値はカルジオリ ビンを結合して いない担体を使用して測定した値である （対照試験） 。 第 2 表 実験区 A s血清 （24U ) Y a血清 （24U ) 実験 I 0.98 2 0.03 2
    [0243] ( 0.01 1 ) ( 0.01 2 ) 実験 I 一 2 0.06 6 0.05 4
    [0244] ( 0.01 0 ) ( 0.01 2 ) 比較 I 一 1 1.28 0 1.10 9
    [0245] ( 1.12 4 ) ( 1.08 2 ) 比較 I 一 2 1.26 0 1.10 2
    [0246] ( 1.10 2 ) ( 1.16 4 ) 実験 Π— 1 0.99 8 0.05 3
    [0247] ( 0.02 2 ) ( 0.05 0 ) 実験 Π— 2 0.08 4 0.09 7
    [0248] ( 0.07 6 ) ( 0.04 5 ) 比較 Π— 1 1.12 5 1.10 0
    [0249] ( 1.02 5 ) ( 1.02 8 ) 比較 Π— 2 1.1 7 1.16 3
    [0250] ( 1.10 1 ) ( 1.10 3 ) 第 2表に示すとおり、 トウ ィーン 2 0による洗浄処 理でカルジォリ ビンの抗原性発現が起こり、 固相化カル ジォビンへの A s抗体の結合性が増強されると共に免疫 グロブリ ンの非特異的なプレー トへの吸着が抑えられる < 方法 （ I ) によって作製された抗リ ン脂質抗体結合用担 体においては物理吸着したカルジオ リ ビンが ト ウ ィーン 2 0 のミセルにリ ビッ ド ト ラ ンスファーすると考えられ, "界面活性剤—リ ン脂質 ' ミセル" の形成がカルジォリ ビンの抗原性を有する三次元構造をブレー ト表面に発現 させるために必須であり、 また ト ウ ィーン 2 0 のミセ ル自身に免疫グロプリ ンの非特異的吸着を抑える作用が ある。 "界面活性剤一 リ ン脂質 · ミセル" の固相化は方 法 （ I ) のみならず方法 （ Π ) でも可能である。 この方 法 （ Π ) は、 最初にカルジォリ ビンのミセルを緩衝液中 で形成させた後、 プレー ト中でイ ンキュベーショ ンし、 ミセルの脂質二重膜を介してカルジォリ ピンをプレー ト 表面に吸着させ、 その後ト ウ ィ ー ン 2 0による洗浄を 行う という方法である。
    [0251] 実施例 4 p B S A処理によるカルジオリ ビン抗原性 発現維持の効果
    [0252] 上記方法 （ I ) と同様の方法で作成したカルジォリ ビ ン結合プレー トを使用し、 このプレー トを P B S Aで処 理した場合 （本発明） と、 未処理の場合 （比較例） につ いて、 プレー トを処理するための トウ ィ ー ン 2 0の添 加濃度を変えて、 抗カルジォリ ビン抗体抗体価の指標と しての吸光度 （450n«)を測定した。 この結果を第 3表に 示す。
    [0253] なお、 界面活性剤による処理は、 各濃度の トウ ィ ーン 2 0を舍有する P B S ( P H 7.4) を使用して行った。 測定したサンプルは、 2 4ユニッ ト （ 2 4 U ) と 1 2ュ ニッ ト （ 1 2 U ) (ハリ スらのユニッ トによる） の A s 血清である。
    [0254] 第 3表
    [0255] 1 weenfe度 本発明 比較例
    [0256] (%) 2 4 U 2 U 2 4 U 1 2 U
    [0257] 0 0.62 1 0.49 2 0.08 2 0.07 9
    [0258] 0.00 5 1 .38 3 0.96 2 1 .02 3 0 .82 3 0.05 1 .39 9 0.98 3 1 .07 9 1 .85 4 0.5 1 .40 1 0.98 1 1 .10 6 0.87 7 第 3表から明らかなように ト ウ ィ ーン 2 0 の抗原性 発現の作用は、 P B S Aによる処理の有無にかかわらず 現われた。 ところが、 カルジオリ ビンの抗原性発現は 1 % P B S Aでの 4。 C、 1時間の処理で有無に促進され ていた。 つまり、 方法 （ I ) でカルジオリ ビンのェタノ ール溶液の乾固の処理の後、 抗原性を有する生理的な 3 次元コ ンフオメーシヨ ンを形成させるには、 トウ ィ ーン 処理のみならず B S A処理でも起こること、 さらにその 両者併用で抗原性発現が促進され、 また安定性が高まり 抗体の非特 的吸着の防止という、 いわゆる "ブロ ッキ ングの促進効果" も得られる。
    [0259] 実施例 5 各種界面活性剤の効果
    [0260] 実施例 4 の本発明方法と同様の方法においてプレー ト を処理するための界面活性剤の種類を変えて A s 血清 ( 2 4 U ) の抗体価の指標としての吸光度 50n«)を測 定した。 その結果を第 4表に示す。 なお、 各界面活性剤 は 0.05 %溶液を使用した。
    [0261] 第 4表 界面活性剤 吸光度 （ 4 5 0 n m ) ト ウ ィ ーン 2 0 1.13 6 ト ウ ィ ーン 6 0 1.02 5 ト ウ ィ ーン 8 0 1.11 9 第 4表から明らかなように、 トウ ィ ーン 2 0 とは疎 水基部分の長さの異なる界面活性剤でも トウ ィ ーン 2 0 と同様の効果が得られた。
    [0262] 実施例 6 ヒ ト血清、 P B S Aおよび界面活性剤を併 用して処理された担体による抗リ ン脂質症 候群特異的抗体の検出
    [0263] 実施例 1 ( 1 ) の方法において、 1 % P B S Aを舍有 する P B による処理に代えてカルジオリ ビン結合プレ ー トを、 5 %健常人血清および 1 % ( W/ V ) p B S A を舍む P B Sで処理したほかは実施例 1 の方法 （ 1 ) と 同様にして本発明の抗リ ン脂質抗体結合用担体を得た。 上記の担体 （本発明） および実施例 1 の方法 （ 1 ) で 得られた担体 （対照） を使用し、 一次反応の反応液に健 常人血清を舍まない 1 %の P B S— B S Aを使用したほ かは実施例 1 と同様の方法で A s血清の抗体価の指標と しての吸光度 U50nm)を測定した。 その結果を第 5表に 示す。
    [0264] 第 5表 実験区 2 4 U 1 2 U 6 U 本発明 1.15 8 0.81 1 0.50 9 対照 0.16 9 0.09 5 0.03 5 第 5表から明らかなように、 抗リ ン脂質抗体結合用担 体を健常人血清、 P B S Aおよび界面活性剤を併用して 処理した際には 1次反応においてヒ ト血清を添加しない 場合でも ヒ ト血清を添加したときと同様の効果が得られ た。
    [0265] 実施例 7 抗リ ン脂質抗体症候群患者血清の測定
    [0266] 実施例 1 の方法 （ I ) によって作成された抗リ ン脂質 抗体結合用担体を使用し、 実施例 1 と同様の方法で健常 人血清検体および S L E患者 （生産群および流産群） 血 清検体の抗カルジォリ ビン抗体価 （ュニッ ト ； un i t (10 ) を測定した。 その結果を第 9図に示す。 第 9図に示され るとおり、 S L E患者血清中の抗カルジオリ ビン抗体価 の指標としての吸光度 （ 450n«)は健常人血清群に比し、 有意に高値を示した。 さらに習慣性流産群においては生 産群 （出産に成功した群） に比べ有意に高い抗体価を示 した。
    [0267] また、 S L E患者血清を舍む自己免疫疾患患者血清 2 4 8例について 1次反応にゥシ胎児血清を用いる従来法 (参考例の方法） および上記の本発明方法によって抗カ ルジオリ ビン抗体価測定し、 両者の相関をもとめ、 結果 を第 1 0図に示した。 第 1 0図中、 縦軸は本発明方法に よる抗体価 （ュニ ッ ト） 、 横軸は従来法による抗体価 (ュニッ ト） 、 破線はカ ツ トオフ値 （健常人血清中の抗 体価の平均 + 3 X標準偏差 （ 1ュニッ ト） ） をそれぞれ 示す。 両者測定系間の相関係数は 0 . 6 6 4であり、 本発 明方法で高分別定量化が見られる。 つまり、 本発明方法 では陽性一陰性の振るい分けがよ く なつている。 この原 因としては前述のごと く感染症由来の抗体 （つまり Y a タイプの抗体） が陰性になるためである。
    [0268] なお、 S L E患者血清 4例および健常人血清 2例につ いて上記本発明方法による希釈曲線 （血清希釈度と抗カ ルジォリ ビン抗体価 （ュュッ ト） との閼係を示す） をも とめた結果を第 1 1図に示す。 第 1 1図から明らかなと おり、 本発明方法は希釈直線性も極めて良好で、 抗体価 の定量性が高いことが示された。
    [0269] 実施例 8 自己免疫疾患患者と感染症患者血清中の抗 リ ン脂質抗体価の比較
    [0270] 実施例 1 の方法 （ I ) と同様の方法によって各種リ ン 脂質を担体に結合させて作成された抗リ ン脂質抗体結合 用担体を使用し、 実施例 1 と同様の方法で自己免疫疾患 ( S L E ) 患者および感染症 （結核および梅毒） 患者の 血清中の抗リ ン脂質抗体価の指標としての吸光度 （450nm) を測定した。
    [0271] それぞれの被検血清について 5 %健常人血清の存在下 および非存在下で測定した結果を第 1 2図に示した。 A s血清は 2 4 U ( 1 / 2 0 0倍濃度に希釈） とし、 それ 以外の被検血清はいずれも 1 Z 1 0 0倍濃度に希釈して 実験に供した。 図中、 上段から順にカルジオリ ビン （ C L ) 、 ホスファチジルイ ノ シ トール （ P I ) 、 ホスファ チジルセ リ ン （ P S ) 、 ホスファチジン酸 （ P A ) 、 ホ スファチジルエタノールァ ミ ン （ P E ) およびホスファ チジルコ リ ン （ P C ) を固相化抗原として用いた際の被 検血清中の抗リ ン脂質抗体の反応性を示している （ C L、 P I、 P S、 P Aは本発明、 P E、 P Cは対照） 。 この 際用いた抗原量は 2.5 S / 5 0 μ 1ノウ ルであ る β
    [0272] 第 1 2図から明らかなとおり陰性荷電をもつ抗原 （つ まり C L、 P I、 P S、 P A) に対しては、 自己免疫性 抗体 （自己免疫疾患に特異的な抗体） は血清の添加によ つて依存的に反応性の増強を示すが、 感染症性抗体 （感 染症に由来する抗体） は血清の添加によって依存的に反 応性が滅少した。 このことにより、 従来分別測定が困難 であった感染症性および自己免疫性の抗リ ン脂質抗体の 分別定量が可能となった。
    [0273] 実施例 9 緩衝液の効果
    [0274] 実施例 1 の方法 （ I ) によって作成された抗リ ン脂質 抗体結合用担体を使用し、 被検液の希釈液として 1 % P B S Aを舍む H E P E S緩衝液 （10mM HEPES, 150mM NaCljpH 7.4)を使用したほかは実施例 1 と同様の方法で
    [0275] A s血清の抗体価の指標としての吸光度 （450nm)を測定 した。 その結果を第 1 3図に示す。 第 1 3図から明らか なように 1次反応の反応液 （被検液の希釈液） として H E P E Sを舍むもの使用した場合、 良好な検量線 （抗カ ルジォ リ ビン抗体価 （ュニッ ト） と吸光度 （450n«)の関 係を示す） が得られ、 抗リ ン脂質抗体症候群由来の抗リ ン脂質抗体の測定に有用であることが分かった。
    [0276] 実施例 1 0 本活性成分の精製
    [0277] 実施例 2の健常人血清分画中の本活性成分 （以下 . 抗 カルジオリ ビン * コファ クターと言う） を以下のように して精製した。
    [0278] ( 1 ) 健常人血清の D E A E—セルロース （ D E— 5 2 ) カラムによるィォン交換力ラムク ロマ トグラフィー
    [0279] 健常人血清中から活性画分を精製するため D E A E— セルロース （ D E— 5 2 ) によるイオ ン交換カラムク ロ マ トグラフィーを行った。 すなわち、 あらかじめ常法に より活性化を行った D EAE—セルロース （D E— 5 2 ) イ オ ン交換樹脂 （ワ ッ トマン社製） 1 5 0 m lを 2 .5X 6 0 cmのガラス製カラムに充塡し、 1 4 mMリ ン酸ナ ト リ ゥム緩衝液 （ p H 7.4) にて平衡化した。 これに、 同 じ緩衝液 3 Lに対して 2日間透折した人血清 1 0 0 m l を力ラム上部から加え、 同じリ ン酸緩衝液 3 Lにて溶出 を行った。 溶出液はフラク ショ ンコ レクタ一にて 1 0 m 1ずつ分取した。 各フラクショ ンの波長 2 8 0 nmの吸 収を測定することで蛋白の溶出状況を検出し、 また後述 の （ B ) の方法にて抗カルジオリ ビン ' コファクターの 活性を測定した。 また、 健常人血清を D E AE—セル口 —スカラムクロマ トグラフィーを行う ことによりコファ クター非依存性抗カルジォリ ビン抗体活性が出現するた め、 同時に非依存性抗カ ルジオリ ビ ン抗体活性を方法 ( B ) にて測定した。 そして、 そのうちコファクター活 性を示す画分を面収した （第 1 4図） 。 面収した活性画 分は常法による限外濾過器もしく は 8 0 %飽和硫酸ァン モニゥムによる塩折により 1 0 0 m l程度に濃縮し次に 示すプロテイ ン A—セルファ ロースカラムクロマ トグラ フィーを 亍った。
    [0280] ( 2 ) コファクター活性含有画分のプロテイ ン Αセファ ロースカ ラムク ロマ ト グラ フ ィ ー
    [0281] コファクターの活性舍有西分から人 I g Gを取り除く ため、 プロテイ ン A—セファ ロースカラムクロマ トグラ フィ ーを行った。 すなわち、 予めプロテイ ン A—セファ ロース （フアルマシア社製） 2 O m l を 1.5X 2 0 cmの ガラス製のカラムに充旗し、 3 m塩化ナ ト リ ウムを舍む 1 .5Mグリ シン緩衝液 （ P H 8.9) にて平衡化した。 こ れに、 先の活性画分 1 0 m l を同じグリ シン菝衝液 1 0 m 1 で希釈した溶液をカラム上部から加え、 同じグリ シ ン緩衝液 1 0 0 m 1 にて溶出した。 溶出液はフラク ショ ンコ レクタ一にて 1 0 m l ずつ分取した。 こう して得ら れた各フラク ショ ンは先に述べた方法と同様にして蛋白 の吸収を測定し、 吸収のビーク部分を回収した （第 1 5 図） 。 回収した部分は、 1 5 0 mM塩化ナ ト リ ウムを舍 む 1 0 m M H E P E S緩衝液 （ p H 7.4) 2 Lに対して 一晩透折した後限外濾過器によつて 5 m l に濃縮し、 次 に示すァフ ィ 二ティーカラムク ロマ トグラフィーを行つ た。 なお、 吸着した I g Gは 1 0 0 mMクェン酸ナ ト リ ゥム緩街液 （ P H 3.0) にて溶出した。
    [0282] ( 3 ) 抗ヒ ト I g G抗体ーセファ ロース C L一 4 Bカラ ムによるァフィ 二ティーク ロマ トグラフィー
    [0283] プロティ ン A非吸着性の I g Gを取り除く ため、 常法 により抗ヒ ト I g G抗体をセファ ロース C L一 4 Bカラ ム樹脂 （フアルマシア社製） に結合させて調製したカラ ムによってァフィ 二ティーカラムク ロマ トグラフィーを 行った。 すなわち、 予め調製した樹脂を 2.0X 5 onのガ ラス製カラムに充塡し、 1 5 0 mM塩化ナ ト リ ウムを舍 む l O mM H E P E S—ナ ト リ ゥム緩衝液 （ P H 7.4) にて平衡化しておき、 （ 2 ) で得た溶液 1 m 1をカラム 上部から加え、 同じ H E P E S緩衝液にて溶出した。 溶 出液はフラクショ ンコ レクタ一にて l m 1ずつ分取した。 各フラクショ ンは先に述べた方法と同様の方法により蛋 白の吸収を測定し、 ビーク部分のフラク ショ ンを回収し た （第 1 6図） 。 回収したフラク ショ ンは一つに集め、 常法によって ドデシル硫酸ナ ト リ ウム （以下 S D Sと略 す） ボリアク リ ルア ミ ド電気泳動を行い、 I g Gが完全 に取り除かれていることを確認した後 （第 1 7図、 F r I N) . 限外濾過器によって 2 m 1 に濃縮した。 また、 吸着した I g Gは 0 ·1Μグリ シン塩酸緩衝液 （ ρ Η 3.0) にて溶出した。
    [0284] ( ) カルジオリ ビン - リ ボソームによるコファ クター の精製
    [0285] ( 3 ) で得た I g Gを完全に取り除いた精製画分 （以 後 F r . 1 Nと称する） からカルジオリ ビン * リポソ一 ムに対してァフィ二ティ一吸着させることによりコファ クタ一を完全精製した。 すなわち、 カルジオリ ビンの 5 m g 1ェタノール溶液 2 m 1を 2 5 m 1容の梨型フ ラスコに取り、 フラスコ壁面に薄いフィルム状になるよ うに真空滅圧下で穏やかに乾固させた。 これに 1 5 0 m M塩化ナ ト リ ウムを舍む 1 0 mM H E P E S緩衝液 （ p H 7.4) 2 m lを加え、 ボルテックスミキサーによって、 1 5分簡激しく撹拌しカルジォリ ビン ♦ リ ボソームを作 製した。 こう して作製したリボソームを （ 3 ) で得た精 製コファ クター溶液 F r . l N ( 1 .2m gノ m l 同 H E P E S緩衝液） に対して同容量加え、 室温で 1 時間静 置し、 リ ボソームにコファクターをァフィ二ティー吸着 させた。 つぎに 1 5 , 00 0 r p m、 4 'Cで 1 5分間遠心 してリ ボソームを回収し、 同じ H E P E S緩衝液にて 3 回遠心洗浄を行った。 各上清は回収し、 未吸着のコ ファ クタ一が無いことを常法による S D Sポリ アク リ ルア ミ ドスラブゲル電気泳動にて確認した。 このとき、 未吸着 のコファクターが存在する場合は、 同様の手順を繰り返 してリ ボソームに吸着させることにより回収した。 この ようにしてコファクターを吸着させたリボソームは、 1 0 0〜5 0 0 1 の同じ 11 £ £ 3緩衝液に懸濁し、 ― 2 0 ΐにて凍結保存した。 この操作によって、 得られた コファ クター吸着リ ポソームを使用した常法による S D Sポリアク リルァミ ドスラブゲル電気泳動にて、 分子量
    [0286] 5万付近にきわめて隣接した 2本のバン ドとして出現す る蛋白が得られた （第 1 7図、 F— 1 ) 。 また、 同時に、 ジパルミ ト イ ルホスファチジルコ リ ン （ D P P C ) ： カ ルジオ リ ビン （ 8 0 ： 2 0、 モル％ ) の 2 m Μリ ポソ一 ム、 並びに D P P C ： ジパルミ トイ ルホスファチジルェ タノ ールァ ミ ン （ D P P E ) ( 8 0 : 2 0、 モル％) の 2 mMリボソームとを使用して、 同様の手順にてコファ クタ一の精製を行った。 その結果、 D P P Cとカルジォ リ ビンからなるリポソ一ムは、 カルジオリ ビン単独のリ ポソームと同様の効果を示した （第 1 7図、 F— 2 ) が、 D P P Cと D P P Eからなる リ ボソームにはコファ クタ 一と思われる成分は吸着されなかった （第 1 7図、 F— 3 ) 。
    [0287] ( 5 ) H P L Cによる リ ボソームに吸着したコファ クタ 一の分離
    [0288] カルジオリ ビン · リボソームにァフ ィ 二ティー吸着さ せて精製したコファクターを逆相カラムを使った H P L Cにて分離した。 すなわち、 コファクターが吸着したリ ポソーム懸濁液を 1 5，00 0 r p mで 1 5分間遠心し、 リ ボソームを回収した。 これに、 1 % S D S水溶液を加 え良く撹拌しリ ボソームを充分溶解させた。 ふたたび同 じ条件で遠心して、 不溶物を沈潑させた後、 上清部分を 逆相カ ラム （ウ ォーターズマイ ク ロボンダースペア一 C— 4カラム （ 3.9X 1 5 cm) ； ウォーターズ社製） を 使用し、 以下に示す条件によって、 付属の吸光度検出器 によって 2 1 5 n mの吸収を測定しながら H P L Cを行 つた。 この様にして精製コフア クターが得られた （第 1 8図） 。
    [0289] コファ クターが吸着したカルジオリ ビン · リ ボソームか らのコファ クタ一分離のための H P L Cの条件 ：
    [0290] 流速 1 m lノ分
    [0291] 圧力上限値 3 0 0 k g ί Ζαδ
    [0292] 圧力下限値 0 k g ίノ ci
    [0293] 流速時間 6 0分
    [0294] 使用送液 A液 0.1% ト リ フルォ口酢酸水溶液
    [0295] B液 ァセ トニ ト リル ： イ ソプロパノ ール （ 3
    [0296] ： 7、 V / V ) に混合したものに 0.07 % ト リ フルォロ酢酸を加えたもの 送液ダラジュン ト条件
    [0297] A液 （％) B液 （％) 時間 0分後 1 0 0 0
    [0298] 6 0分後 4 0 6 0
    [0299] ( 6 ) 杭カルジォ リ ピン ' コファ クターのう >孑量及び等
    [0300] コファクターの等電点並びに分子量を調べるため、 A n d e r s 0 n らの方法による I S 0 D A L Tゲル電気 泳動を行った。 まず、 （ 3 ) で得られた溶液 F r . 1 N について泳動を行った （第 1 9図） 。 第 1 9図に示す通 りいく つかのスボッ トが出現したが、 力ルジォリ ピン · リボソームに吸着したコファクタ一は第 1 9図に示すス ポッ ト Ν(λ 1 0および No.1 2であることが （ 5 ) で得られ た精製コファ クターの S D Sボリ アク リルア ミ ド電気泳 動の結果 （第 1 7図、 F— 1 ) より判明した。 つまり、 第 1 9図より コファ クターの等電点は 6 .75で分子量 4 9 ,60 0 (No.10) 及び等電点 6.60、 分子量 50,000
    [0301] ( Να 1 2 ) であった。 尚、 これらの 2つの成分はァミノ 酸配列が同一でそれらの糟鎮が相違するかもしく は部分 的にアミノ酸の官能基が何等かの修飾を受けた蛋白質に 相当し、 コファクターのサブタイプと考えられる。
    [0302] し Β ) カルジオリ ビン · コファ クター活性-並びにコフ ァクター非依存性杭カルジォリ ビン抗体活性の測定方法 健常人血清中に舍まれる、 抗カルジオリ ピン · コファ クター活性並びにコファクター非依存性抗カルジォリ ピ ン抗体活性は以下の方法によって、 測定された。
    [0303] 参考例 1 に示した方法とほぼ同様にして測定した。
    [0304] すなわち、 カルジオリ ビンをコー トした 9 6穴マイ ク 口プレー トを、 0 .05 %ツイ一ンを舍む P B S緩衝液 ( P H 7.4) ； 以下洗浄液とする） を 1 ゥ ュル当り 2 0 0 u 1 にて洗浄する操作を 3回操り返し、 プレー トを活 性化させる。 そして測定するサンプルを 1 ゥヱル当り
    [0305] 5 0 ^ 1ずつ分注する。 次に、 コファクター活性を測定 するゥヱルには、 あらかじめ 1 5 O mM塩化ナ ト リウム 及び 1 %B S Aを舍む 1 O mM H E P E S緩衝液 （ p H 7.4 ; 以下希釈緩衝液とする） にて 2 0 0倍に希釈して おいた A s血清を 5 0 1 を、 一方非依存性カルジォリ ピン抗体活性を測定するゥエルには、 希釈緩衝液を 5 0 U 1 ずつ分注し、 室温で 3 0分間静置する。 そして、 こ れ以降の操作は、 両活性測定法とも同じ操作を行う。 す なわち、 両方のゥ ルとも洗浄液にて 3面洗浄した後、 1 5 0 mMの塩化ナ ト リ ウム、 1 %B S A及び I mME
    [0306] D TAを舍む 1 O mM H E P E S緩衝液 （ P H 7.4) に て適度に希釈した西洋ヮサビ由来のペルォキシダーゼを 結合させた抗人 I g G抗体を 1 0 0 1 ずつ分注し、 室 ¾で 3 0分間静置する。 さらに 3回洗浄液で洗浄した後. 0.3mMTM B Z及び 0.03 %過酸化酸素水 （ 1 0 0 ^ 1 ) を基質溶液として加え、 1 0分間反応させた後に、 ブレー ト リーダーによって 4 5 0 n mの吸光度を測定し た。
    [0307] 試験例
    [0308] 抗カルジオリ ビン ' コファクターの特性を調べるため 以下の試験を行った。
    [0309] ( 1 ) ピオチン化抗カルジオ リ ビン · コファ クターの調 製
    [0310] 免疫実験操作法 （昭和 5 5年 2月 2 0 日、 日本免疫学 会発行 （細胞抗原 DIの 1 5 — 5 9 , P 2 4 2 5 ) ) の熊 谷及び奥村らの方法に準じて、 実施例 1 0の （ 3 ) で精 製された抗カルジオリ ビン · コファ クター 1 m gをビォ チン化し、 抗カルジオリ ビン ' コファ クターを標識化し た。
    [0311] ( 2 ) 杭カルジオリ ビン · コファ クターのカルジオリ ビ ンへの結合性
    [0312] 9 6 ウ エノレマイ ク ロタイ タープレー トの各ウ ェ レに 2.5〃 g / 5 0 1 Zゥヱルずつカルジオリ ビン · エタ ノール溶液を加え、 減圧乾燥し、 1 %B S A舍有 P B S で 1時間反応させた後、 0.05 %T w e e n 2 0含有 P B S ( 2 0 0 〃 1 ) で 3面洗浄した。 このカルジォリ ビン固相化プレー トに、 第 2 0図に示す通り 0〜 3 2 gノ m 1 のピオチン化抗カルジオリ ビン · コファ クター ( 1 0 0 # 1 ) を 3 0分室温にて反応させ、 3回洗浄後 アビジン化ペルォキシダーゼを室温で 3 0分反応させた β 更に 3面洗浄後、 1 0 0 1 の 0.3mM TM B Z及び 0.00 3 %の過酸化水素水を入れ、 1 0分間室温にて反 応させた後、 1 0 0 1 の 2 N硫酸を加えることで反応 を停止した。 反応液の吸光度を測定することにより、 固 相化カルジオリ ビンと結合した抗カルジオリ ビン ' コフ ァクターを定量した。
    [0313] 第 2 0図に示す通り、 ビォチン化抗カルジオリ ビン · コファ クターは濃度依存的に固相化カルジォリ ビンに結 合性を示した。
    [0314] ( 3 ) 各種リ ン脂皙に対するビォチン化抗カルジォリ ビ ン · コファ クターの結合特異性
    [0315] 上記 （ 2 ) と同様の方法で各種リ ン脂質 （つまりカル ジオリ ビン， ホスファチジルセリ ン （ P S ) , ホスファ チジルイ ノ シ トール （ P I ) , ジノヽ 'ルミ トイルホスファ チジン酸 （ D P P A ) ， ジバルミ トイ ルホスファチジル コ リ ン （ D P P C ) 及びジパルミ トイルホスファチジル エタノールァ ミ ン （ D P P E ) ) を 2.5^ gZ5 0 〃 l /ゥヱルずつ固相化したプレー トで、 ビォチン化抗カル ジオリ ビン . コファ クターの結合特異性をァビジン化ぺ ルォキシダーゼを用いて調べた。 第 2 1図に示す通り、 抗カルジオリ ビン · コファ クターの結合は陰性荷電をも つリ ン脂質 （カルジオリ ビン、 P S , P I , D P P A ) に特異的であつた。
    [0316] ( 4 ) 杭カルジオリ ビン杭体の反応系における杭カルジ オ ^ピン * コフ クターの依存性 上記 （ 2 ) と同様の E L I S A法により、 抗リ ン脂質 抗体症候群に特異的に存在する抗カルジオリ ビン抗体 (A s血清） と固相化カルジオリ ビンとの反応系に抗カ ルジオリ ビン · コファ クター （ 2 gノゥヱル） を添加 して、 抗カルジオ リ ビン抗体と固相化カルジオリ ンとの 反応について抗カルジオリ ビン · コファ クター依存性を 調べた。 第 2 2図に示す通り、 抗カルジオリ ビン抗体は 添加した抗体カルジォリ ピン ' コファ ターに依存的に 反応した。
    [0317] ( 5 ) 抗カルジオリ ビン ' コファ クターの種特異性
    [0318] 上記 （ 2 ) と同様の E L I S A法にて種の異なる抗カ ノレジオリ ビン . コファ クター （ヒ ト及びゥ シ由来） の活 性を評価したところ、 ゥシ由来のコファ クターを用いる と自己免疫性 （A s血清） 及び感染症 （Y a血清） の抗 カルジオリ ビン抗体の反応性を共に高めるが、 ヒ ト由来 のコファクターを用いると自己免疫性抗体 （A s抗体） のみの反応性を高める活性が認められた。 （第 2 3図） · 実施例 1 1
    [0319] 健常人血清からの分画物の採取
    [0320] (1) D EAE—セルロースカラムク ロマ トグラフ ィ一に による分画物の採取
    [0321] 1 4 mMリ ン酸ナ ト リ ゥム緩衝液 （ P H 7· 4 ) (以下、 P B 7.4 ) で一晩透折した健常人血清 （ 1 m l ) を予め P B 7.4にて平衡化した D EAE—セファ ロースカ ラム ( 1 0 m l、 1.0 x l 3 cm、 ワ ッ トマン社製 D E— 5 2 ) にかけ、 素通り画分を l m lずつ回収した。 各分画 2 5 u 1を用いて、 抗リ ン脂質抗体症候群患者血清中 (A s ) に特異的に出現する抗カルジォク ビン抗体と固 相化カルジオリ ビンとの反応性を高める活性と、 梅毒患 者血清中 （ S y ) に存在する抗カルジォリ ビン抗体と固 相化カルジォクビンとの反応性を抑制する活性を、 参考 例 1及び実施例 1 0の （ A ) の方法とほぼ同様にして測 定した。
    [0322] 結果は第 2 図に示した。
    [0323] ( 2 ) へバリ ンセファ ロースカラムク ロマ トグラフィー による分画物の採取
    [0324] 5 0 m M N a C 1舍有 1 0 m Mリ ン酸ナ ト リ ウム緩 衝液、 p H 7.4で平衡化したへパリ ン一セファ ロース - カ ラム （ 6 m l、 1.0 ^ X 8 cm フアルマシア社製） に 同緩衝液に対して一晩透折した健常人血清 1 m 1を吸着 させ、 カ ラムを同緩衝液で十分洗浄した後、 N a C l濃 度 5 0 mM〜 1 Mまでの濃度勾配で溶出させた。 各分画 1 5 1を用いて抗リ ン脂質抗体症候群患者血清中 （A s ) に特異的に出現する抗カルジオリ ビン抗体と固相化 カルジォリ ビンとの反応性を高める活性と、 梅毒患者血 清中 （ S y ) に存在する抗カルジオリ ビン抗体の固相化 カルジォリ ビンとの反応性を抑制する活性を、 参考例 1 及び実施例 1 0の （A) の方法を準じて測定した。
    [0325] 結果は第 2 5図に示した。
    [0326] ( 3 ) カルジオリ ビン一アク リルア ミ ドゲルカラムク ロ マ トグラフ ィ一による分画物の採取
    [0327] i ) カルジオ リ ビン一ボリ アク リ ルア ミ ドカ ラムの調製 ゥ シ心臓カルジオ リ ビン （ 5 m 0 1 e s ) 、 コ レス テロール （ 5 i/ m o 1 e s ) 、 ジセチルフ ォ スフェー ト ( 0.5 〃 m o l e s ) をナシフラスコ中でフ イ ノレム状に 減圧乾燥させ、 更に 5 0 0 u 1 のエタ ノールを加え 6 0 て程度に加温し脂質を溶解した。 次に 5 m 1 の 1 5 %ァ ク リルア ミ ド、 5 %ビスアク リ ルア ミ ド溶液を加え激し く ボルテッ クス ミキサーで攪拌し、 更に 1 0 0 〃 1 の過 硫酸ァ ンモニゥム （ 1 O O m g Zm l ) 、 及び 2 1 の
    [0328] T E M E Dを加えボリ マー化した。 ポリ マー化ゲルをホ モジナイ ズしカラム （ 1. Ο Χ 3 η) に詰め 5 0 mMN a C 1舍有 1 0 mMリ ン酸ナ ト リ ウム緩街液、 P H 7. 4 で十分洗浄平衡化した。
    [0329] ϋ ) ァフニティーカラム ' ク ロマ トグラフ ィ ー
    [0330] 5 0 mM N a C 1含有 1 0 mMリ ン酸ナ ト リ ゥム锾街 液、 p H 7. 4で一晩透折した健常人血清 1 m 1 をカラム に通した後、 同緩衝液で十分に洗浄し 1. 0 MN a C 1 舍 有 1 0 mMリ ン酸ナ ト リ ウム緩衝液、 P H 7.4で吸着性 の蛋白を溶出した。 各分面 1 5 i« 1 を用いて抗リ ン脂質 抗体症候群患者血清中 （A s ) に特異的に出現する抗カ ルジォリ ビン抗体と固相化カルジォリ ビンとの反応性を 高める活性と梅毒患者血清中 （ S y ) に存在する抗カル ジォリ ビン抗体と固相化カルジォリ ピンとの反応性を抑 制する活性を参考例 1及び実施例 1 0の （ A ) の方法に 準じて測定した。
    [0331] 結果は第 2 6図に示した。
    [0332] 以上に示した通り、 D E A E—セルロースカラムクロ マ トグラフィー、 へパリ ンセファ ロースカラムク ロマ ト グラフィー、 あるいはカルジオリ ビン一アク リルア ミ ド ゲルカラムクロマ トグラフィ一を用いて健常人血清から 本発明の分画物を得ることができる。
    [0333] 実施例 1 2
    [0334] 杭カルジオリ ビン · コファ ク ターの活袢
    [0335] 抗リ ン脂質抗体症候群患者血清中 （A s ) 中の抗カル ジオリ ビン抗体とカルジオリ ビンとの反応性を高める活 性 （A s †活性） と梅毒患者血清中に存在する抗カルジ オリ ビン抗体のカルジオリ ビンとの反応性を抑制する活 性 （ S y i活性） の発現を調べた。
    [0336] カルジオリ ビン固相化プレー トをツイーン 2 0舍有 P
    [0337] B Sにて洗浄の後、 第 6表に示した各血清群の 3 , 4群 を実施例 1 0の （ 3 ) で得られたコファクター （ 1 0 gノ m 1 ) で 3 0分間処理し、 対照群についてはコファ クタ一溶解緩衝液で処理をした。 この処理の後、 ツイ一 ン 2 0舍有 P B Sにて 3面洗浄し、 血清 A s ( 1 / 4 0
    [0338] 0倍希釈、 1 2 5 U/m l ) 、 および S y ( 1 / 2 0 0 倍希釈） をコファクター （ 1 0 / gZm l ) 存在下 （ 2 , 4群） もしく は非存在下 （ 1 , 3群） で室温 3 0分間反 応させた。 以下の操作は参考例 1及び実施例 1 0の （ A) と同じである。 第 6表に示す通り、 A s †活性を得るためにコファ ク ターを上記のごと く前処理するか、 抗体との反応系に存 在させるか、 もしく はその両方に存在させる。 S y 活 性を得るためにはコファ タターが前処理の時に存在して もよいが、 抗体との反応系に存在させる必要がある。
    [0339] 第 6 表
    [0340] 患 Aコィ
    [0341] コファ クター 者フン S
    [0342] 群 血キまア 吸光度 前 処 理 清たュク ン
    [0343] べタはと ( 450nm) S
    [0344] A s
    [0345] とシ. V
    [0346] 1群 の}ョ 0. 1 0 2
    [0347] 2 » + 1. 0 5 1
    [0348] 3 " + 0. 8 2 6
    [0349] 4 " + 十 1. 1 0 2
    [0350] 1群 1. 1 0 6
    [0351] 2 " 十 0. 7 1 0
    [0352] 3 " 十 1. 1 2 5
    [0353] 4 » + + 0. 8 5 0
    [0354] 実施例 1 3
    [0355] 参考例 1及び実施例 1 0の （ A ) の方法とほぼ同様の 方法を採用して、 抗リ ン脂質抗体症候群患者血清中 （ A s ) の抗カルジオリ ン抗体とカルジォ リ ビンとの反応性 を高める活性 （A s †活性） と梅毒患者血清中 （ S y ) に存在する抗カルジオリ ビン抗体とカルジオリ ンとの反 応性を抑制する活性 （ S y i活性） に及ぼす精製ゥシ血 清アルブミ ンの影響を調べた。
    [0356] 本測定法で純度の高い脂質を舍まないゥシ血清アルブ ミ ン （ B S A ) および精製コファクター （実施例 1 0の ( 3 ) で得られたコファ クター） を用いるとき S y i活 性が反応液中の B S A濃度に依存して減少する （第 27図） これはコファ クタ一分子上の S y I活性発現部位が精製 アルブミ ン （ B S A ) によってブロ ック されることによ ると思われ、 従って B S A濃度を 0 — 5 % (特に 0 — 1
    [0357] %) の範囲で使用するのが望ましい。
    [0358] 実施例 1 4
    [0359] コファ クターのァ ミノ酸配列の決定
    [0360] 実施例 1 0の （ 3 ) の方法によって得られたコファク ターを、 更に実施例 1 1 の'（ 3 ) で用いたカルジオリ ビ ンーァク リ ノレア ミ ドゲルカラムク ロマ トグラフ ィ一に付 して吸着させ、 次いで 1 モル N a C 1 で溶出させて精製 したコファ クター （このコファ クター中には実施例 1 0 の （ 6 ) で同定された 2つのサブタイプが含まれている） の N末端アミノ酸配列を決定した。 すなわち、 サンプル 3 0 〃 1 ( 3 0 0 p m o l ) を P V D F膜 （ポリ ビニリ デンダイフルオライ ド ； ミ リ ポア社製 ； 商品名、 ィ モビ ロ ン） に吸着させ、 6 0 %メ タノ ールで洗浄した後気相 プロテイ ンシーケンサー （ P S Q— 1型， ㈱島津製作所 製） を使用して分析を行った。 以上の操作により、 コ フ ァ クターの N末端より 5偭のァミノ酸配列を決定した。
    [0361] 1 5
    [0362] 結果 ： NH2-Gly-Arg-Thr-X-Pro-Lys-Pro
    [0363] ( Xは C y s又は H i s と推定される） 産業上の利用可能性
    [0364] 本発明により、 界面活性剤単独、 界面活性剤と精製血 清アルブミ ンとの併用、 またはさらにこれらと本発明血 液成分を併用して処理された抗リ ン脂質抗体結合用担体 を使用し、 及びノ又は第 1 の抗原抗体反応 （ 1 次反応） において本発明血液成分を反応液に添加するこ とによつ て、 従来の方法では十分に分別できなかった抗リ ン脂質 抗体症候群由来の抗リ ン脂質抗体と感染症由来の抗リ ン 脂質抗体を再現性よ く分別する方法を確立した。 本発明 方法を用いるこ とによって抗リ ン脂質抗体症候群の診断 を極めて正確に行う ことができる。
    [0365] また本発明血液成分は、 抗リ ン脂質抗体症候群に特異 的に存在する抗体とリ ン脂質との結合性を高め、 感染症 に由来する抗リ ン脂質抗体とリ ン脂質との結合性を低下 させる作用を有する。 従って、 これらの血清もし く は血 漿、 分画物または蛋白質を、 抗リ ン脂質抗体症候群に特 異的に存在する抗体の免疫学的測定法に用いることによ り、 抗リ ン脂質抗体症候群の診断を正確に行う ことがで きるとともに、 抗リ ン脂質抗体症候群と感染症における それぞれの抗リ ン脂質抗体を分別して検出できる。
    权利要求:
    Claims 請 求 の 範 囲
    1. リ ン脂質を結合した担体物質が精製血清アルブミ ン および界面活性剤で処理されていることを特徴とする抗 リ ン脂質抗体結合用担体。
    2. リ ン脂質が、 そのホスホジエステル結合の近位に電 子供与性官能基を有するものである請求の範囲第 1項記
    ROPOUHI
    載の抗リ ン脂質抗体結合用担 Z H Ϊ一体。
    3. リ ン脂質が、 一般式 [ I ]
    C H 2 0 — R
    I
    C H - 0 [ I 3
    C H 2 0 0 R
    [式中、 R 1 および！？ 2 は同一または異なり、 炭素鎖 中にアルキル基もしく はアルケニル基を有するァシル基. アルキル基またはアルケニル基を示し、 R3 は水素原子 または一 （ C H2 ) n - C H R4 一 R5 を示し、 R4 は 水素原子、 水酸基、 カルボキシ基、 ホルミル基、 メ ルカ ブト基もしく はハロゲン原子を示し、 R5 はァミ ノ基、 ヒ ドロキシアルキル基もし く は一般式 [ Π ] C H 2 —— 0 R
    I
    [式中、 R 1 および R 2 は前記と同意義。 ] で表され る置換基を示し、 または R < と R 5 とで糖もしく は糖ァ ルコール残基を示し、 nは 0 ないし 3 の整数を示す。 ] で表されるグリセロ リ ン脂質である請求の範囲第 2項記 載の抗リ ン脂質抗体結合用担体。
    4 . 一般式 [ I ] で衷されるグリ セ口リ ン脂質が、 カル ジオ リ ビン、 ホスファチジルセ リ ン、 ホスファ チジルイ ノ シ トール、 ホスファチジルグリ セロールまたはホスフ 7チジン酸である請求の範囲第 3項記載の抗リ ン脂質抗 体結合用担体。
    5 . カルジオリ ビンが、 微生物由来または哺乳動物の心 臓由来のものである請求の範囲第 4項記載の抗リ ン脂質 抗体結合用担体。
    6 '.' '微生物が、 大腸菌である請求の範囲第 5項記載の抗 リ ン脂質抗体結合用担体。
    7 . 精製血清アルブミ ンが、 脂質舍量を減少させたもの である請求の範囲第 1項記載の抗リ ン脂質抗体結合用担 体。
    8 . 担体物質が、 反応液不溶性の担体物質である請求の 範囲第 1項記載の抗リ ン脂質抗体結合用担体。
    9. 反応液不溶性の担体物質の材質が、 有機高分子化合 物である請求の範囲第 8項記載の抗リ ン脂質抗体結合用 担体。
    1 0. 有機高分子化合物が、 ポリ塩化ビニル、 ボリスチ レン、 スチレ ン一ジビュルベンゼン共重合体、 スチ レン
    —無水マ レイ ン酸共重合体、 ポリ ビュルアルコール、 ボ リ アク リ ルア ミ ド、 ボリ プロ ピレ ンまたはポ リ メ チ レン メ タク リ レー トである請求の範囲第 9項記載の抗リ ン脂 質抗体結合用担体。
    1 1. リ ン脂質と担体物質との結合が物理的吸着による ものである請求の範囲第 1項記載の抗リ ン脂質抗体結合 用担体。
    1 2. 界面活性剤が非イ オ ン性界面活性剤である請求の 範囲第 1項記載の抗リ ン脂質抗体結合用担体。
    1 3. リ ン脂質を結合した担体物質が精製血清アルブミ ン、 界面活性剤および血清、 血漿、 その分画物もしく は その分酉物中の蛋白質で処理されていることを特徴とす る抗リ ン脂質抗体結合用担体。
    1 4. 抗リ ン脂質抗体症候群の免疫学的診断に使用され る請求の範囲第 1〜 1 3項のいずれかに記載された抗リ ン脂質抗体結合用担体。
    1 5. 請求の範囲第 1 4項記載の抗リ ン脂質抗体結合用 担体を使用することを特徴とする抗リ ン脂質抗体の免疫 学的測定法。
    1 6. リ ン脂質が結合した抗リ ン脂質抗体結合用担体と 被検液とを接触させて抗リ ン脂質抗体症候群に特異的に 存在する抗体と該担体に結合したリ ン脂質との免疫複合 体を形成させて該抗体を検出する方法において、 抗リ ン 脂質抗体結合用担体として請求の範囲第 1 〜 1 3項のい ずれかの担体を使用することを特徴とする免疫学的測定 方。
    1 7 . 抗リ ン脂質抗体結合用担体と被検液とを接触させ て被検液中の抗リ ン脂質抗体と担体上のリ ン脂質との免 疫複合体を形成させる第 1 の抗原抗体反応工程と、 該免 疫複合体と標識抗ィ ムノ グロブリ ン抗体とを反応させて 該免疫複合体と標識抗ィムノグロプリ ン抗体とからなる サン ドィ ツチ状免疫複合体を形成させる第 2の抗原抗体 反応工程と、 ついで該サ ン ドィ ッチ状免疫複合体を舍む 相と担体に結合しなかった物質を舍む相とを分離する分 離工程と、 いずれ力 ^相の標識物質を検出する検出工程 とからなる方法において、 抗リ ン脂質抗体結合用担体と して請求の範囲第 1〜第 1 3項のいずれかの担体を使用 し、 少なく とも第 1 の抗原抗体反応工程を反応液に被検 液と同種もしく は類緣の動物に由来する血清、 血漿、 そ の分画物もしく はその分画物中の蛋白質を添加して行う ことを特徴とする免疫学的測定法。
    1 8 . 抗リ ン脂質抗体結合用担体と被検液とを接触させ て被検液中の抗リ ン脂質抗体と担体上のリ ン脂質との免 疫複合体を形成させる第 1 の抗原抗体反応工程と、 該免 疫複合体と標識抗ィムノ グロプリ ン抗体とを反応させて 該免疫複合体と標識抗ィムノグロプリ ン抗体とからなる サ ン ドィ ツチ状免疫複合体を形成させる第 2の抗原抗体 反応工程と、 ついで該サン ドィ ツチ状免疫複合体を舍む 相と担体に結合しなかった物質を舍む相とを分離する分 離工程と、 いずれかの相の標識物質を検出する検出工程 とからなる方法において、 抗リ ン脂質抗体結合用担体が リ ン脂質を結合した担体物質を界面活性剤で処理したも のであること、 および少なく とも第 1 の抗原抗体反応ェ 程を反応液に被検液と同種もしく は類緣の動物に由来す る血清、 血漿、 その分画物もしく はその分画物中の蛋白 質を添加して行う ことを特徴とする免疫学的測定法。
    1 9 . 標識抗ィ ムノグロプリ ン抗体が酵素、 放射性同位 元素、 蛍光物質またはこれらの標識物質を舍有するリボ ソ一ムで標識されたものである請求の範囲第 1 7項また は 1 8項記載の免疫学的測定法。
    2 0 . 抗リ ン脂質抗体結合用担体が、 担体物質として反 液に不溶性の担体物質を使用した請求の範囲第 1 7項 または 1 8項記載の免疫学的測定法。
    2 1 . 少なく とも下記構成試薬から構成される請求の範 囲第 1 7項に記載された免疫学的測定法に使用するキッ
    ( Α ) 請求の範囲第 1項または 1 3項記載の抗リ ン脂質 抗体結合用担体、
    ( B ) 標識抗ィムノグロプリ ン抗体、
    ( C ) 被検液と同種もしく は類緣の動物に由来する血清. 血漿、 その分面物もし く はその分画物中の蛋白質を添加 した検体希釈液
    2 2， 少なく とも下記構成試薬から構成される請求の範 囲第 1 8項に記載された免疫学的測定法に測定するキッ 卜 o
    ( Α ' ) リ ン脂質を結合した担体物質が界面活性剤で処 理されている抗リ ン脂質抗体結合用担体、
    ( Β ) 標識抗ィムノ グロプリ ン抗体、
    ( C ) 被検液と同種もし く は類緣の動物に由来する血清、 血漿、 その分画物もしく はその分画物中の蛋白質を添加 した検体希釈液。
    2 3 . 血清もしく は血漿をゲル濾過して得ることができ る分画物であって、 抗リ ン脂質抗体症候群に特異的に存 在する抗体とリ ン脂質との結合性を高める作用を有する 分画物。
    2 4 . 血清もしく は血漿から得ることができる分画物で あって、 抗リ ン脂質抗体症候群に特異的に存在する抗体 とリ ン脂質との結合性を高める作用を有し、 且つ以下の 理化学的性質を有する分画物 ：
    ①分画分子量 6，0 0 0〜 8，0 0 0 のセルロース膜を用い て透折すると非透折画分に含まれる ；
    ②ゲル濾過または S D S —ポリ アク リルァミ ドゲル電気 泳動によって分画すると血清アルブミ ンの近傍か、 僅か に低分子側に確認される ；
    ③プロテイ ン Αと結合しない ； ④ジェチルァミノェチル基を舍む弱塩基性陰ィオン交換 体によるクロマ トグラフィーにおいて I g G画分の近傍 に溶出される ；
    及び⑤ 3 0〜6 0 %飽和硫酸ァ ンモニゥムで塩折される 画分に含まれる。
    2 5 . 血清もしく は血漿から得ることができる蛋白質で あって、 抗リ ン脂質抗体症候群に特異的に存在する抗体 とリ ン脂質との結合性を高める作用を有し、 且つ以下の 理化学的性質を有する蛋白質 ；
    ① S D Sポリ アク リルア ミ ド電気泳動により測定される 分子量が約 5 0 , 0 0 0 ± 2 , 0 0 0で等電点が約 6 . 6 0 土
    0 . 4である ；
    及び②リ ン脂質に対して結合性を有する。
    2 6 . 血清から請求の範囲第 2 5項記載の蛋白質を単離 精製するに際し、 請求の範囲第 3項記載の式 [ I ] で示 される リ ン脂質からなるリポソ一ム、 該リ ン脂質を 1つ の構成成分とするリ ボソーム、 あるいは該リ ン脂質を結 合したァフィ二ティ一吸着剤を用いて精製する工程を舍 むことを特徴とする請求の範囲第 2 5項記載の蛋白質の 製造法。
    2 7 . リ ン脂質が結合した抗リ ン脂質抗体結合用担体と 被検液とを接触させて抗リ ン脂質抗体症候群に特異的に 存在する抗体と該担体に結合したリ ン脂質との免疫複合 体を形成させて該抗体を検出する方法において、 該免疫 複合体を形成させる際に、 反応液中に、 高濃度の血清も しく は血漿、 請求の範囲第 2 3 もしく は 2 4項記載の分 画物または請求の範囲第 2 5項記載の蛋白質を存在させ ることを特徴とする免疫学的測定法。
    2 8 . 高濃度の血清もしく は血漿、 請求の範囲第 2 3項 もしく は 2 4項記載の分画物または請求の範囲第 2 5記 載の蛋白質を構成試薬の 1つとして舍む、 抗リ ン脂質抗 体症候群に特異的に存在する抗体を測定する免疫学的測 定法に使用するキッ ト。
    2 9 . リ ン脂質が結合した抗リ ン脂質抗体結合用担体と 被検液とを接触させて抗リ ン脂質抗体症候群由来の抗リ ン脂質抗体と感染症由来の抗リ ン脂質抗体とを分別検出 する方法であって、 リ ン脂質が結合した抗リ ン脂質抗体 結合用担体と被検液とを接触させる際に、 反応液中に高 濃度の血清もしく は血漿、 請求の範囲第 2 3 もしく は 2 4項記載の分画物、 または請求の範囲第 2 5項記載の蛋 白質を存在させて接触させる方法と、 これらを存在させ ないで接触させる方法の両者を実施して、 抗リ ン脂質抗 体症候群由来の抗リ ン脂質抗体と感染症由来の抗リ ン脂 質抗体とを分別検出する方法。
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    公开号 | 公开日 | 专利标题
    Guesdon et al.1979|The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques.
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    NZ237535A|1993-05-26|
    DE69028513D1|1996-10-17|
    EP0450099A1|1991-10-09|
    DE69028513T2|1997-02-06|
    AT142789T|1996-09-15|
    AU640699B2|1993-09-02|
    EP0450099B1|1996-09-11|
    CA2044142A1|1991-04-20|
    US5506110A|1996-04-09|
    EP0450099A4|1991-12-27|
    AU6532190A|1991-05-16|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1991-05-02| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AU CA JP KR US |
    1991-05-02| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IT LU NL SE |
    1991-06-13| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 2044142 Country of ref document: CA |
    1991-06-17| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1990915194 Country of ref document: EP |
    1991-10-09| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1990915194 Country of ref document: EP |
    1996-09-11| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1990915194 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP1/272536||1989-10-19||
    JP27253689||1989-10-19||
    JP2/74960||1990-03-23||
    JP7496090||1990-03-23||
    JP2/185870||1990-07-13||
    JP18587090||1990-07-13||DE69028513T| DE69028513T2|1989-10-19|1990-10-19|Träger zur bindung von antiphospholipid-antikörpern, diese antikörper verwendender immunotest und kit dafür|
    EP90915194A| EP0450099B1|1989-10-19|1990-10-19|Carrier for binding antiphospholipid antibody, immunoassay using the same, and kit therefor|
    US08/076,365| US5506110A|1989-10-19|1993-06-14|Carrier for binding of anti-phospholipid antibodies, and immunoassay method using the same and a kit therefor|
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